在使用高压锅灭菌时，需注意排除锅内的冷空气，可通过关闭排气阀后升火或打开排气阀释放冷气两种方法实现。灭菌时间不宜过长或过短，过长会导致养分破坏，过短则灭菌不彻底。灭菌结束后，放气速度应缓慢，以避免棉塞被冲出。若无高压锅，可采用土蒸汽锅灭菌，但需延长灭菌时间。间歇灭菌法也可用于母种培养基的灭菌，即每天蒸煮1小时，连续三天。灭菌后的培养基应立即取出，直立放置2～3分钟，待试管壁上的水珠回到培养基内，再搁置斜面。原种、栽培种的灭菌则需使用较大灭菌锅。采用高压蒸汽锅灭菌时，应逐渐加大火力，以防止温差过大导致瓶子破裂。灭菌时间根据培养基原料种类和生熟程度调整，如木屑、棉壳等需1.5kg/cm2压力下60分钟，稻草、粪草培养基需90分钟，麦粒培养基则需120分钟。