培养基的灭菌是保证发酵生产无菌环境的重要步骤。母种培养基灭菌通常采用高压锅，每瓶培养基应扎成一捆，并用防潮纸包裹棉塞，防止灭菌过程中潮湿。高压锅内水位需控制在适当位置，过少或过多都会影响灭菌效果。灭菌时间应根据压力设定，一般在1.2kg～1.5kg/cm2下保持15～20分钟。
在使用高压锅灭菌时，需注意排除锅内的冷空气，可通过关闭排气阀后升火或打开排气阀释放冷气两种方法实现。灭菌时间不宜过长或过短，过长会导致养分破坏，过短则灭菌不彻底。灭菌结束后，放气速度应缓慢，以避免棉塞被冲出。
若无高压锅，可采用土蒸汽锅灭菌，但需延长灭菌时间。间歇灭菌法也可用于母种培养基的灭菌，即每天蒸煮1小时，连续三天。灭菌后的培养基应立即取出，直立放置2～3分钟，待试管壁上的水珠回到培养基内，再搁置斜面。
原种、栽培种的灭菌则需使用较大灭菌锅。采用高压蒸汽锅灭菌时，应逐渐加大火力，以防止温差过大导致瓶子破裂。灭菌时间根据培养基原料种类和生熟程度调整，如木屑、棉壳等需1.5kg/cm2压力下60分钟，稻草、粪草培养基需90分钟，麦粒培养基则需120分钟。
土锅灭菌时，在98℃～100℃下需连续灭菌6～8小时，麦粒培养基需12小时。塑料薄膜袋装菌种培养基可采用常压灭菌，100℃保持8～12小时，聚丙烯塑料薄膜可在1.5kg/cm2压力下保持2小时，灭菌彻底且不会破裂。
灭菌完毕后，培养基应放置于清洁、凉爽、干燥的室内冷却待接，并在棉塞上喷洒5%石炭酸或0.25%新洁尔灭溶液，以防杂菌感染。
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