1、线性化目的载体：用酶切或是PCR方式。2、PCR获取目的片段。设计的引物5’端需要和线性化载体末端有15~25bp的重叠。3、按照一定比例把二者混合在HB-infusion（无缝克隆试剂盒）的2×预混液内，50℃反应20min后直接转化Ecoli即可。