无菌操作技术原则 方法和注意事项

无菌操作技术是指综合地运用各种灭菌和消毒手段，在无菌区域内使用无菌的工具完成各项指定的操作过程。其任何一个操作过程都要注意避免把其他任何无关的菌体带入到培养基中。

无菌操作目的是使接种物和被接种物免受其他微生物的污染，从而经培养获得纯培养物，即菌种。这就需要操作环境和操作工具无菌，接种物和被接种物无杂菌。然而，在菌种生产过程中，有多种因素制约无菌操作，如接种室达不到绝对无菌状态，接种物和被接种物包装容器表面也由于接种前暴露于有菌环境中而带有杂菌，接种人员服装鞋帽也不是完全无菌状态，这使得无菌操作环境中会有微生物（杂菌）悬浮，而且随接种操作时间的延长而增加。这些微生物主要来源于接种物和被接种物的表面，特别是被接种物数量大时，携带的微生物更多。因此在进行食用菌菌种分离、接种的过程中所有操作均应在无菌条件下进行，其操作要点是在酒精灯火焰附近进行熟练操作，或在接种箱、无菌室的无菌环境下进行操作。接种箱或无菌室可在使用前用紫外线灯或化学药剂灭菌。

（1）无菌操作基本要求

环境要清洁，进行无菌操作前半小时，须停止清扫地面等工作。避免不必要的人群流动，防止尘埃飞扬。进行无菌操作时，衣帽穿戴要整洁。帽子要把全部头发遮盖，口罩须遮住口鼻。无菌物品与非无菌物品应分别放置。无菌物品不可暴露在空气中，必须放于无菌容器内，无菌物品一经使用后，必须再经灭菌处理后方可使用。从无菌容器中取出的无菌物品，虽未使用，也不可放入无菌容器内。取无菌物品时，必须用无菌持物钳或镊。未经消毒的用品不可触及无菌物。进行无菌操作时，如器械、用品疑有污染或已被污染，即不可使用，应更换或重新灭菌。

（2）无菌操作过程及操作规程

为了获得高纯度的食用菌菌种，在食用菌菌种分离、接种操作中首先应创造无菌操作条件，在无菌操作过程中，最重要的是要保持工作区的无菌、清洁。一般菌种分离、接种操作在无菌室、接菌箱或超净化工作台和酒精灯火焰旁进行。因此，接种箱或超净化工作台在操作前20～30min要先启动紫外线灯。其次操作时须注意操作要点：所有使用器皿均须严格灭菌；接种用的培养基须事先做无菌培养试验；双手用75%的酒精棉消毒；操作过程不得离开酒精灯火焰10cm范围；操作要正确、迅速；接种工具使用之前和之后须经火焰灼烧灭菌，才能接种或放在桌上；棉塞不能乱放，操作时始终夹在手指中，棉塞也应适当燎烤后再塞回试管。操作结束后，应分类处理各类用品及材料，然后关闭无菌操作台。无菌操作必须注意两点：①严格树立无菌观念；②严格遵循无菌操作规程。无菌操作规程可归纳为以下几点。

①用空间消毒方法，净化操作环境（制种与生产上主要有无菌室、接种箱、超净工作台等），达到局部空间消毒所要求的净化程度。

②任何操作器具都必须经过消毒灭菌处理，尤其是接种工具要经过湿热灭菌、酒精擦拭、火焰燃烧等多种表面消毒灭菌处理后，才可用于接种。

③操作人员换好清洁的衣服，用新洁尔灭溶液清洗菌种容器表面，双手用75%的酒精棉球消毒后方能操作。

④菌种分离、接种都应在酒精灯火焰附近的无菌区中进行。任何一种培养基开口时，都必须倾斜向下，并用火焰封口。棉塞也应适当燎烤后再塞回试管。

⑤操作要迅速，尽量减少培养物在空间的暴露时间。

（3）无菌操作的注意事项

①接种前要准备好一些无菌棉塞，一起放入无菌室（箱）内，以便更换受潮棉塞。

②接种时切勿使试管口离开酒精灯火焰的无菌区，试管口略向下倾斜，以减少杂菌污染机会。

③接种工具应在酒精灯火焰上灼烧灭菌；接种过程中，接种工具碰到有菌的地方应重新灼烧灭菌。

④接种方法正确，接种人员操作熟练，配合默契；接种时人在室内尽量不走动或少走动，不戴口罩时要尽量少说话，以减少空气流动扬起的尘灰污染。

⑤接种时留下的污物，如用过的酒精棉、菌种碎屑、分离物残余等要及时清除，以免引起污染。