lncRNA研究策略之：RNA Pull Down实验技术

RNA pull-down是检测RNA结合蛋白与其靶RNA之间相互作用的主要实验手段之一。RNA pull-down使用体外转录法标记生物素RNA探针，然后与胞浆蛋白提取液孵育，形成RNA-蛋白质复合物。该复合物可与链亲和素标记的磁珠结合，从而与孵育液中的其他成分分离。复合物洗脱后，通过Western Blot实验检测特定的RNA结合蛋白是否与RNA相互作用。

1) lncRNA筛选：

通过lncRNA芯片或RNA测序等方法对多对疾病模型和对照样本组织进行lncRNA表达谱分析；

通过生物信息学的方法筛选出具有表达差异的lncRNA，构建共表达网络，预测lncRNA的靶基因；

通过PCR或Northern Blot技术对候选lncRNA验证，确定其表达差异。

2) lncRNA确定：

通过5' RACE获取lncRNA 5'全长，3' RACE获取lncRNA3'全长，最终拿到完整的lncRNA序列。

3) 表达分析：

细胞水平表达：在细胞水平进行检测表达差异。

组织分布：检测不同组织、不同阶段表达特性。

表达水平动力学变化：比较不同处理条件下，如药物处理、诱导处理下，表达水平差异。

4) 功能研究：

功能获得性研究：构建lncRNA过表达载体:原则上是将全长lncRNA定向克隆到表达载体上实现lncRNA的过表达。然而有些lncRNA很大或全长尚未分离，这时将视lncRNA在基因组上的定位采取不同的研究策略。

功能缺失性研究：可通过siRNA、shRNA、反义核酸等方法沉默lncRNA，干预lncRNA后检测其对疾病相关基因表达的影响和对细胞表型如增值、凋亡、侵袭、转移等的影响；

采用RNA pull down、RNA-RIP(RNA Binding Protein Immunoprecipitation)、ChIRP-seq(Chromatin Isolation by RNA Purification)等方法检测与lncRNA结合的DNA、RNA、蛋白质。

采用lncRNA芯片分析技术结合mRNA对lncRNA功能进行预测，研究lncRNA trans和cis作用机制。

采用配体指数级富集系统进化技术(systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX)，设计一种RNA配体，与癌症相关的lincRNA结合达到抑制肿瘤细胞的生长和转移。

采用快速预测RNA与蛋白质相互作用与结构域（catRAPID）在线算法来预测RNA与蛋白质的相互作用，该算法根据RNA和蛋白质的二级结构、氢键和分子作用力来评估它们之间的相互作用的倾向。

采用非编码RNA沉默和定位分析（c-KLAN）技术对lncRNA进行功能缺失（Loss-of-function）研究和细胞定位，该技术是在基于核糖核酸内切酶制备的小干扰RNA（esiRNA）和荧光原位杂交（FISH）2种现有的研究方法的基础上建立起来的。

5) 表达：将lncRNA表达与其他领域相结合，解释lncRNA机理。

DNA甲基化：可通过检测相应基因甲基化差异与lncRNA结合分析。

转录因子：研究lncRNA与转录因子的机制。

染色质重塑：lncRNA表观。

一.质粒转化、涂板、摇菌

1.取JM109感受态细菌80μl，加入管中，用10μl头沾取质粒加入上述EP管中，混匀。

2.冰上静置30min。

3.42℃热休克90-120s。

4.迅速移至冰上静置2min。

5.在超净台内，于上述EP管中加入50μlLB培养基（Amp－），37℃，160rpm摇床，增菌。

6.菌液4,000rpm离心10min，弃大部分上清，将沉淀重悬，菌液全部加入LB平板（Amp+）上，涂布均匀，37℃倒置培养（过夜12-15h）。

7.将37℃培养（12-16h）平板取出，于无菌操作台中挑取单克隆放入内含5mlLB培养基（Amp+）的15ml离心管中，于37℃、250rpm摇床增菌过夜18H,看菌液是否浑浊。菌液浑浊后进行质粒中提。

二.质粒中提（TIANGEN，DP107-02）

1.柱平衡：向吸附柱CP3中（吸附柱放入收集管中）加入500μl的平衡液BL，12,000rpm离心1min，尽量吸除上清。

2.取过夜培养的菌液，加入离心管中，使用常规台式离心机，12,000rpm离心1min，尽量吸除上清。

3.向留有菌体沉淀的离心管中加入250μl溶液P1使用移液器彻底细菌沉淀。

4.向离心管中加入250μl溶液P2，温和的上下翻转6-8次使菌体充解。

5.向离心管中加入350μl溶液P3，立即温和的上下翻转6-8次，充分混匀，此时将出现白色絮状沉淀，12,000rpm，离心10min，此时在离心管底部形成沉淀。

6.将上一步收集的上清液用移液器转移到吸附柱CP3中，12,000rpm，离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3放入收集管中。

7.向吸附柱CP3中加入500μl去蛋白液PD，12,000rpm离心，离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3重新放回收集管中。

8.向吸附柱CP3中加入600μl去蛋白液PW，12,000rpm离心，离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3重新放回收集管中。重复一次。

9.将吸附柱CP3重新放回收集管中，12000rpm离心2min。

10.将吸附柱CP3置于一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位滴加50μl洗脱缓冲液EB，室温放置2min，12,000rpm离心2min，将质粒溶液收集到离心管中，放冰盒，测浓度。

三.质粒线性化：

本实验使用的酶为Biolabs的重组酶KpnⅠ。

酶切后进行跑胶。

四.琼脂糖凝胶电泳

1.配胶。成分：琼脂糖粉、TBE、ⅠH2O，少量EB。

与H2O混合加入放好琼脂糖粉的锥形瓶中，摇匀，放入微波炉加热1-2min。

3.滴加少量EB，于锥形瓶中摇匀。

4.倒入胶板中，插入梳子，待琼脂糖凝固。

5.小心拔掉梳子，取10μl样品加入1μl的10×LoadingBuffer缓缓加入点样孔，并在最右边的点样孔加5μlDNAmaker。

6.接通电源。

7.电泳完毕，关闭电源。从胶模中取出琼脂糖凝胶，于紫外灯下切下目的条带。

五.胶回收（TIANGEN，DP214-02）

1.向吸附柱CB2中加入500μl平衡液BL，12,000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

2.将单一的目的DNA条带从琼脂糖凝胶中切下放入干净的离心管中，称取重量。

3.向胶块中加入等倍体积溶液PC，50℃水浴放置10min左右，其间不断的上下翻转离心管，以确保胶块充分溶解。

4.将上一步所得溶液加入一个吸附柱CB2中12,000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB2放入收集管中。

5.向吸附柱CB2中加入600μl漂洗液PW，12,000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB2放入收集管中。

6.重复操作步骤⑤。

7.将吸附柱CB2放入收集管中，12,000rpm离心2min，尽量除去漂洗液。将吸附柱置于室温放置数分钟，彻底晾干。

8.将吸附柱CB2放入一个干净的离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加适量的洗脱缓冲液EB，室温放置2min，12,000rpm离心2min，收集DNA溶液。

六.转录以及生物素标记：

1.取无RNA酶管，按下表操作：2.取出孵育好的EP管，加入2μl的DNaseⅠ，37℃孵育15min以除去体系中的DNA。

3.取出上述操作的EP管，加入2μ（pH=）终止反应。

4.取1μgBiotin标记的RNA，加入适量StructureBuffer,使得RNA形成二级结构。然后将RNA95℃加热2min，冰浴3min，室温静置30min。

5.磁珠准备：使用RIPWashBuffer500μl冲洗磁珠3次。

6.用50μlRIPWashBuffer重悬磁珠，然后将其加入到生物素标记并变性的RNA中，4℃过夜。

7.过夜的混合物3000rpm离心1min，去上清。

冲洗3次，切记将液体沿壁加入或者滴加，上下缓慢翻转混匀，切勿用移液器吹打。

9.往磁珠-RNA混合物中加入细胞裂解液，裂解液中加入适量RNase抑制剂，室温放置1h。

10.将孵育好的磁珠-RNA-蛋白混合物低速离心，上清回收，使用RIPWashBuffer冲洗3次，1次1ml。

11.于样品中加5×SDS上样缓冲液，95℃变性10min，跑SDS-PAGE凝胶。

12.考染：取出SDS-PAGE凝胶于考马斯亮蓝染色液中，摇床过夜。次日用考马斯亮蓝脱色液脱色1~2h，中间更换几次脱色液至条带清晰，背景低为止。

13.将目的条带切下送测序(质谱检测)。

问题1：RNA降解

可能原因：

1）无核酸酶的环境被破坏

2）体外转录的RNA探针降解

解决办法：

1）清洗和使用新开的离心管和试剂等

2）RNA探针合成后，电泳检测其长度和浓度

问题2：RNA结合蛋白的亲和力不够：

可能原因：

1）结合缓冲环境没有优化

2）裂解不完全

3）磁珠用量不足

4）RNA探针用量不足

解决办法：

1）优化孵育时间、温度、盐浓度等条件

2）增加裂解液和蛋白上样量的比例

3）增加裂解液

4）增加磁珠用量

5）增加探针用量

6）确定生物素和链霉亲和素效率

问题3：RNA结合蛋白没有结合

可能原因：

1）靶蛋白量不足

2）缓冲体系不对

3）RNA探针和蛋白的亲和力本来就低

解决办法：

1）增加上样蛋白量

2）应用低盐体系

3）加入交联试剂

问题4：结合的非特异性高

可能原因：

1）缓冲环境没有优化

2）缓冲环境严谨性低

3）样品没有裂解完全和裂解体系没有优化

解决方法：

1）优化孵育时间温度盐浓度等条件

2）使用严谨性高的缓冲体系

3）调低RNA探针和样品的比例

4）提高裂解液的量

问题5：WB信噪比高

可能原因：

1）阳性信号率低

2）一抗效率低

3）蛋白没有充分溶解

解决方法：

1）增加二抗的量

2）用敏感度的化学发光液

3）用细胞裂解液预孵一抗

4）增加样品的量

5）确定有没有其他可能的结合情况

6）增加裂解液用量下载本文