本方案已由下列人员审查并批准
| 文件责任 | 职位 | 签字 | 日期 |
| 报告者 | |||
| 审核者 | |||
| 审核者 | |||
| 批准者 |
2.接受标准:
2.1试验用菌悬液每1ml含菌数应小于100cfu。
2.2 培养基配制后无菌性检查和营养性检查需符合要求。
2.3 培养基的pH值应符合相应培养基的要求。
3.操作程序：
3.1实验仪器及器具：
生化培养箱LRH-250A（广东省医疗器械厂， 30-35℃, 23-28℃, 20-25℃）；XG1.DMX-0.36B型脉动真空灭菌器（山东医疗器械股份有限公司 编号10.0311）；FE20型pH计（梅特勒）；灭菌生理盐水；移液管；试管；双碟。
3.2验证培养基：硫乙醇酸盐流体培养基TGB(德国merk)，大豆酪蛋白消化肉汤培养基TSB(德国merk)，营养琼脂培养基NA(德国merk)，萨布罗葡萄糖琼脂培养基SDA(德国merk)、平板计数培养基PCA(德国merk)、远腾琼脂培养基ENA(德国merk)、硫酸月桂醇肉汤LST(德国merk)、亮绿乳糖肉汤培养基BGLBB (德国merk)、麦康凯琼脂培养基Mac.A (德国merk)、大豆酪蛋白消化琼脂培养基TSA(德国merk)、假单胞菌分离琼脂培养基PIA (BD)、绿脓荧光素测定用培养基PAF (德国merk)、绿脓菌素测定用培养基PAP (德国merk)、 甘露醇胆盐琼脂培养基 (MSA) (德国merk)、溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基（CET）(德国merk)、沙门氏菌增菌培养基(RVSB) (德国merk)、木糖赖氨酸脱氧胆盐琼脂XLD(德国merk)、麦康凯肉汤培养基Mac.B(德国merk)、曙红亚甲蓝琼脂培养基EMB(德国merk)、三糖铁琼脂TSI(德国merk)、萨布罗葡萄糖肉汤培养基SDB(德国merk)、梭菌增菌培养基RCM(德国merk)、哥伦比亚琼脂培养基CA(德国merk)、肠肝菌增菌培养基EEB-M(德国merk)、紫红胆汁葡萄糖培养基VRBGA(德国merk)
3.3试验菌:
金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus [ATCC 6538]
大 肠 埃 希 菌Escherichia coli [ATCC 8739]
沙门氏菌Salmonella typhimurium [ATCC 14028]
铜 绿 假 单 孢 菌Pseudomonas aeruginosa [ATCC 9027]
枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis [ATCC6633]
生孢梭菌Clostridium sporogenes [ATCC 19404]
白色念珠菌Candida albicans [ATCC 10231]
黑曲霉Aspergillus niger [ATCC 104]
3.4菌悬液的制备：
3.4.1各取金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌、生孢梭菌斜面培养物一支，无菌操作接种一白金耳至TSB管中，30-35℃培养24-48小时，其中生孢梭菌需厌氧培养，取出置2－8℃贮存使用7天，每次使用前用灭菌生理盐水或灭菌水稀释至含菌约为10－100cfu/ml。
3.4.2取白色念珠菌斜面培养物一支，无菌操作接种一白金耳至TSB管中， 20-25℃培养48-72小时，取出置2－8℃贮存使用7天。取黑曲霉菌SDA斜面培养物用灭菌生理盐水洗脱孢子，置2－8℃贮存使用7天。每次使用前用灭菌生理盐水或灭菌水稀释至含菌约10－100cfu/ml。
3.4.3菌悬液计数
3.4.3.1无菌操作吸取菌悬液1ml，加入含灭菌稀释剂100ml的三角瓶中，摇匀成10-2稀释液，同样操作制备10-4和10-6稀释液（必要时也可作更大倍数稀释）。
3.4.3.2每种菌悬液备好二只灭菌双碟和融化好并放至50℃的NA培养基和RNA培养基TSA培养基和SDA培养基。
3.4.3.3向双碟内注入10-6稀释液（必要时可以是其它浓度稀释液）1ml。
3.4.3.4向含稀释液的双碟内加入备好的培养基约20ml，迅速振摇混合稀释液和培养基，并放置使凝固成平板，其中生孢梭菌置于厌养袋中。
3.4.3.5翻转双碟置适宜温度培养(金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌、生孢梭菌30-35℃培养24-48小时，白色念珠菌和黑曲霉菌20-25℃分别培养2-3天和3-5天)。
3.4.3.6计数平板上的菌落数求出平均值，得到稀释液的菌浓度要求应为含菌10-100 cfu/ml，若不在此范围内可以改变稀释倍数，得到含菌符合要求的稀释液。
3.5实验步骤
3.5.1培养基的制备
3.5.1.1硫乙醇酸盐流体培养基（TGB）
| 酪胨（胰酶水解） 15.0g |
| 葡萄糖 5.0g |
| L-胱氨酸 0.5g |
| 硫乙醇酸钠 0.5g 或硫乙醇酸 0.3ml 新配制的0.1%刃天青溶液 1.0 ml |
| 酵母浸出粉 5.0g |
| 氯化钠 2.5g |
| 琼脂 0.7g |
| 纯化水 1000ml |
3.5.1.2大豆酪蛋白消化肉汤培养基(TSB)
| 胰酪胨 15.0g |
| 大豆胨 5.0g |
| 氯化钠 5.0g |
| 纯化水 1000ml |
3.5.1.3营养琼脂培养基 (NA)
| 胨 | 5.0g |
| 肉浸出粉 | 3.0g |
| 琼脂 | 12.0g |
| 纯化水 | 1000ml |
3.5.1.4萨布罗葡萄糖琼脂培养基： (SDA)
| 葡萄糖 | 40.0 g |
| 胨（肉和酪蛋白） | 10.0 g |
| 琼脂 | 15.0 g |
| 纯化水 | 1000 ml |
3.5.1.5平板计数培养基： (PCA)
| 胰酶消化酪蛋白 | 5.0g |
| 酵母膏 | 2.5g |
| 葡萄糖 | 1.0 g |
| 琼 脂 | 15.0g |
| 纯化水 | 1000ml |
3.5.1.6远腾琼脂培养基： (ENA)
| 蛋白胨 | 10.0g |
| 磷酸氢二钾 | 2.5g |
| 无水亚硫酸钠 | 3.3g |
| 乳糖 | 10.0g |
| 阿拉伯胶 | 0.3g |
| 琼 脂 | 12.5g |
| 纯化水 | 1000ml |
3.5.1.7硫酸月桂醇肉汤（LST）
| 胰蛋白 | 20.0 g |
| 乳糖 | 5.0 g |
| 氯化钠 | 5.0 g |
| 硫酸月桂醇钠 | 0.1g |
| 磷酸氢二钾 | 5.0 g |
| 磷酸二氢钾 | 1.0 g |
| 蛋白胨 | 10.0 g |
| 纯化水 | 1000 ml |
3.5.1.8亮绿乳糖肉汤培养基（BGLBB）
| 蛋白胨 | 10.0 g |
| 乳糖 | 10.0 g |
| 干牛胆 | 20.0 g |
| 亮绿 | 0.0133g |
| 纯化水 | 1000 ml |
3.5.1.9麦康凯琼脂培养基 (Mac.A)
| 胰酶消化明胶 | 17.0g |
| 蛋白胨 | 3.0g |
| 乳糖 | 10.0 g |
| 氯化钠 | 5.0g |
| 胆盐混合物 | 1.5g |
| 琼脂 | 13.5g |
| 中性红 | 30mg |
| 结晶紫 | 1.0mg |
| 纯化水 | 1000ml |
3.5.1.10大豆酪蛋白消化琼脂培养基： (TSA)
| 胰酶消化酪蛋白 | 15.0g |
| 番木瓜酶消化大豆 | 5.0g |
| 氯化钠 | 5.0g |
| 琼脂 | 15.0g |
| 纯化水 | 1000ml |
3.5.1.11假单胞菌分离琼脂培养基（PIA）
| 蛋白胨 | 20.0g |
| 氯化镁 | 1.4g |
| 硫酸钾 | 10.0g |
| 氯苯酚 | 0.025g |
| 琼 脂 | 13.6g |
| 纯化水 | 1000ml |
3.5.1.12绿脓荧光素测定用培养基 (PAF)
| 胰酶消化酪蛋白 | 10.0g |
| 动物组织胃蛋白消化酶 | 10.0g |
| 无水磷酸二氢钾 | 1.5g |
| 硫酸镁 (MgSO3.6H2O) | 1.5g |
| 甘 油 | 10.0ml |
| 琼 脂 | 15.0g |
| 纯化水 | 1000ml |
3.5.1.13绿脓菌素测定用培养基(PAP)
| 胰酶消化明胶 | 20.0g |
| 无水氯化镁 | 1.4g |
| 无水磷酸二氢钾 | 10.0g |
| 琼 脂 | 15.0g |
| 甘 油 | 10.0ml |
| 纯化水 | 1000ml |
3.5.1.14甘露醇胆盐琼脂培养基(MSA)
| 胰酶消化酪蛋白 | 5.0g |
| 动物组织胃蛋白消化酶 | 5.0g |
| 牛肉膏 | 1.0g |
| D-甘露醇 | 10.0 g |
| 氯化钠 | 75.0g |
| 琼 脂 | 20.0g |
| 酚红 | 0.025g |
| 纯化水 | 1000ml |
3.5.1.15溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基（CET）
| 胰酶消化明胶 | 20.0g |
| 氯化镁 | 1.4g |
| 硫酸钾 | 10.0g |
| 琼 脂 | 13.6g |
| 西曲溴铵 | 0.3g |
| 甘 油 | 10.0ml |
| 纯化水 | 1000ml |
3.5.1.16沙门氏菌增菌培养基(RVSB)
| 大豆酪蛋白 | 4.5g |
| 水合氯化镁 | 29.0g |
| 氯化钠 | 8.0g |
| 硫酸钾 | 0.4g |
| 磷酸二氢钾 | 0.6 g |
| 孔雀绿 | 0.036g |
| 纯化水 | 1000ml |
3.5.1.17木糖赖氨酸脱氧胆盐琼脂(XLD)
| 木 糖 | 3.5g |
| L-赖氨酸 | 5.0g |
| 乳 糖 | 7.5g |
| 蔗 糖 | 7.5g |
| 氯化钠 | 5.0g |
| 酵母膏 | 3.0g |
| 酚 红 | 80mg |
| 琼 脂 | 13.5g |
| 脱氧胆酸钠 | 2.5g |
| 硫代硫酸钠 | 6.8g |
| 枸橼酸铁（III）铵 | 800mg |
| 纯化水 | 1000ml |
3.5.1.18麦康凯肉汤培养基 (Mac.B)
| 胰酶消化明胶 | 20.0g |
| 乳糖水合物 | 10.0g |
| 胆汁 | 5.0g |
| 溴甲酚紫 | 10.0mg |
| 纯化水 | 1000ml |
3.5.1.19曙红亚甲蓝琼脂培养基(EMB)
| 胰酶消化明胶 | 10.0g |
| 磷酸二氢钾 琼脂 乳糖 曙红Y | 2.0g 15.0g 10.0 g 400mg |
| 亚甲基蓝 | 65mg |
| 纯化水 | 1000ml |
3.5.1.20三糖铁琼脂 (TSI)
| 胰酶消化酪蛋白 | 10.0g |
| 动物组织胰酶消化物 | 10.0g |
| 乳 糖 | 10.0g |
| 蔗 糖 | 10.0g |
| 葡萄糖 | 1.0g |
| 硫酸铁（III）铵 | 200mg |
| 氯化钠 | 5.0g |
| 硫代硫酸钠 | 200mg |
| 琼 脂 | 13.0g |
| 酚 红 | 25mg |
| 纯化水 | 1000ml |
3.5.1.21萨布罗葡萄糖肉汤培养基 (SDB)
| 葡萄糖 | 20.0 g |
| 胨（肉和酪蛋白） (1:1) | 10.0 g |
| 纯化水 | 1000 ml |
3.5.1.22梭菌增菌培养基 (RCM)
| 牛肉浸出粉 | 10.0g |
| 蛋白胨 | 10.0g |
| 酵母浸出粉 | 3.0g |
| 可溶性淀粉 | 1.0g |
| D-葡萄糖-水合物 | 5.0g |
| 盐酸半胱氨酸 | 0.5g |
| 氯化钠 | 5.0g |
| 醋酸钠 | 3.0g |
| 琼脂 | 0.5g |
| 纯化水 | 1000ml |
3.5.1.23哥伦比亚琼脂培养基(CA)
| 胰酪蛋白胨 | 10.0 g |
| 动物蛋白酶消化物 | 5.0 g |
| 胰酶消化物 | 3.0 g |
| 酵母浸出粉 | 5.0 g |
| 玉米淀粉 | 1.0 g |
| 氯化钠 | 5.0 g |
| 琼脂 | 14.0 g |
| 纯化水 | 1000 ml |
3.5.1.24肠肝菌增菌培养基 (EEB-M)
| 牛肉膏 | 3.0g |
| 胰酶消化明胶 | 5.0g |
| 水合乳糖 | 5.0g |
| 纯化水 | 1000ml |
3.5.1.25紫红胆汁葡萄糖培养基（VRBGA）
| 酵母浸出粉 | 3.0g |
| 胰酶消化明胶 | 7.0g |
| 胆汁盐 | 1.5g |
| 氯化钠 | 5.0g |
| 水合葡萄糖 | 10.0g |
| 琼脂 | 15.0g |
| 中性红 | 30mg |
| 结晶紫 | 2mg |
| 纯化水 | 1000ml |
3.5.1.25 取出所需配制的干粉培养基,检查干粉培养基是否处于有效期内。根据配制需求量,按干粉培养基包装瓶上的配方准确称取所需的干粉培养基,并做好相应的《干粉培养基配制记录》（FARD-QC-304）及《灭菌原始记录》（FARD-211-037），见附件1。
3.5.2培养基的无菌性检查
3.5.2.1按照《微生物试验用培养基适用性检查操作程序》（FASOP-QC-032-7）“4.5 培养基灭菌性检查”。
3.5.2.2填写《配制的培养基无菌检查记录》，见附件1。
3.5.4 培养基的PH测定
用pH计测定培养基pH值，pH计的使用见《FE20型实验室pH计操作程序》（FASOP-QC-1136） 见附件2，填写《培养基pH值记录》见附件1。
3.5.4培养基的营养性检查
3.5.4.1按照《微生物试验用培养基适用性检查操作程序》（FASOP-QC-032-7） “4.6.3 促生长试验” 见附件2。
3.5.4.2填写《培养基促生长试验原始记录》(FARD-QC-034)，见附件1。
3.5.4 将配制好经过无菌性检查和营养性检查合格后的培养基置于2-25 C恒温环境中存放，每间隔一个月取相应的培养基进行培养基pH测定、无菌性检查和营养性检查（按步骤“3.5.2”、“3.5.3”和3.5.4进行操作），需验证的培养基每间隔一个月的检测结果如符合3.6 结果要求，则继续放置在要求温度的恒温环境中，放置至第4个月。
3.6实验结果
3.6.1 无菌检查结果均应澄清或无菌落生长。
3.6.2 pH值应在灭菌后各培养基要求的pH值范围内。
3.6.3培养基营养性检查的结果
3.6.3.1按照《微生物试验用培养基适用性检查操作程序》（FASOP-QC-032-7）‘‘4.7 结果判断”
3.6.3.2若培养基至第4个月经无菌性检查和营养性检查均符合要求则培养基的有效期定为3个月；若培养基经无菌性检查和营养性检查有任何一项不符合要求则规定培养基有效期的不得超过该次存放时间前一次检测间隔的时间（例如，培养基在第3个月检测结果不符合要求，则培养基的有效期不得超过2个月）。
3.7本方案实施前应对参与本验证的人员进行培训。
4.参考文献
4.1中国药典. 二部附录H 无菌检查法、J 微生物限度检查法.国家药典委员会.
4.2 ICH. Protocol Template Qualification of the USP/ Ph.Eur./JP Microbiological Examination Tests for Non-sterile Drug Products,Drug Substances and Excipients(Version 1,Version 2).2007.
4.3 United States Pharmacopoeia Chapters. <61>Microbiological Examination of Non-sterile Products: Microbial Enumeration Tests, <62>Microbiological Examination of Nonsterile Products: Tests for Specified Microorganisms, <1111>Microbiological Quality of Non-Sterile Pharmaceutical Products,and <1227>Validation of Microbial Recovery for Pharmacopoeia Articles.
4.4European Pharmacopoeia Chapters.<2.6.12> Microbiological Examination of Nonsterile Products: Microbial Enumeration Tests, <2.6.13> Microbiological Examination of Nonsterile Products: Test for specified Micro-organisms,and <5.1.4>Microbiological Quality of Pharmaceutical Preparations.下载本文
