1目的和要求

(1)了解大肠菌群在食品卫生检验中的意义

(2)学习并掌握大肠菌群的检验原理和方法，以判别食品的卫生质量

2原理

大肠菌群之一群能在37℃经24h能发酵乳糖，产生气体，需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。该菌主要来源于人畜粪便，故以此作为粪便污染指标来评价食品的卫生质量，具有广泛的卫生学意义。它反映了食品是否被粪便污染，同时间结指出食品是否有肠道致病菌污染的可能。

三步法：（1）发酵乳糖，产气产酸发酵试验；（2）初发酵阳性管通过伊红美兰平板进行分离；（3）复发酵对分离菌做证实实验。

食品中大肠菌群数系以每100g（或100ml）检样内大肠菌群最近数(the most probable number 简称MPN)表示。最近数MPN法是一种将样品“多次（管）稀释至无菌”的计数方法。将3个稀释梯度的待检验样品稀释液接种于9支或15支试管培养基中，每个稀释梯度试液接种3或5支。经过培养后，根据结果查阅MPN检索表，就可以得到原样品中微生物的估计数量。MPN检测方法尤其适用于带菌量、其他方法不能检测的食品，如水、乳制品及其其他食品中大肠菌群的计数。

3材料

3.1样品

乳、肉、果汁、糕点、发酵调味品及其他食品。本实验对象菠萝汁和果粒橙

3.2菌种

大肠埃希氏菌（Escherichia coli）、产气杆菌（Enterobacteria aerogenes） 

3.3 培养基及其试剂

乳糖胆盐发酵管（单料或双料）、乳糖发酵管、伊红美兰琼脂干粉（EMB）、革兰氏染色液、无菌生理盐水（9ml/试管，225ml/250ml三角瓶，内含有适量玻璃珠）、75%酒精棉球等

3.4其他

恒温箱、恒温水域、药物天平、无菌培养皿、无菌吸管（1ml、10ml）、无菌不锈钢勺、无菌称量纸、质均器、载玻片等  

4流程

样品↓ 无菌称量25g

稀释↓  温热的225ml灭菌生理盐水锥形瓶；再作1:10稀释度（即取1ml第一次稀释后的样品，加入到9ml的生理盐水中去）再作1:100稀释度

接种、培养↓  取1ml试样接种到接种到乳糖单眼发酵液中，每个梯度稀释液作3次接种，并在 24±2h，36±1℃ 条件下进行培养

初发酵结果分析↓  若不产气，即为大肠杆菌阴性，报告大肠杆菌阴性；气，则划线伊红美兰琼脂平板23±3h、36±1℃进行培养

分离结果↓  革氏染色：若为G+阳性，报告大肠杆菌阴性；若为G-阴性则为无芽孢杆菌

接种（复发酵）↓ 乳糖发酵管中24±2h，36±1℃ 件下培养

最终结果产气报告大肠杆菌阳性；不产气报告大肠杆菌阴性

5步骤  

5.1实验准备 

取样稀释，做成1:10、1:100、1:1000的均匀稀释液为检样。同一稀释梯度接种3个乳糖胆盐发酵管，并用大肠埃氏菌、产气肠杆菌作为对照。

以无菌操作取样25g（或25ml）置于225g（或225ml）灭菌生理盐水的广口瓶中（瓶内放置适量的玻璃珠）或灭菌研钵中，经充分摇匀或研磨制成1:10的均匀稀释液。固体试样在加入稀释液后，最好置于灭菌匀质器中以8000～10000r/min的匀速处理1min，置成1：10的稀释液

用1.0ml的灭菌吸管吸取1:10的稀释液1.0ml，沿管壁徐徐注入含有9.0ml的灭菌生理盐水的试管中（注意吸管尖端不要试管内的液面），振摇试管混合均匀，制成1:100的稀释试样。另取1.0ml的灭菌吸管，以相同方法制成10倍递增的稀释液试样，每次换用1支1.0ml的灭菌吸管。

5.2乳糖胆盐发酵试验

根据食品卫生要求或对待检测样污染程度进行估计，选择三个稀释度，每个稀释度接种三管乳糖胆盐发酵管。接种量在1ml以上者用双料乳糖胆盐发酵管，1ml及1ml以下者用单料乳糖胆盐发酵管，同时用大肠埃希氏菌和产气肠杆菌混合接种于1支单料乳糖胆盐发酵管对照。置于24±2h，36±1℃条件培养，如果所有发酵管都不产气，则可以报告为大肠菌群为阴性；如果产气的试管，则与对照的混合菌种一起按以下步骤进行操作。

5.3分离培养

将产气发酵罐分别在伊红美兰琼脂（EMB琼脂）平板上划线分离，然后24±2h，36±1℃培养，观察菌落的形态，并作革兰氏染色和证实实验。

5.4证实实验

上述平板上挑去可疑大肠菌落1～2个进行革兰氏染色，同时接种乳糖发酵管24±2h，36±1℃培养，观察产气情况，凡乳糖发酵管产气、革兰氏染色为阴性的无芽孢杆菌，即可报告达产菌群阳性。

5.5报告

根据证实为大肠菌群阳性的管数，查MPN表，报告100g（或100ml）大产菌群的MPN值。

6结果 

 6.1 验结果表

 6.2 结果报告

根据证实大肠菌群的阳性管数，查MPN检索表报告每100g（或100ml）大肠菌群的最可能数。

7思考  

1.验中为什么要首先用乳糖胆盐发酵管？

2.作空白对照实目的？

3.为什么大肠菌群检验要经过复发酵才能证实？

4.复发酵时为什么使用乳糖发酵管但不用加胆盐/

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