王琛 2010021141
摘 要: DNA序列分析在现代生物学和生命科学中扮演着重要的角色。人类基因组计划极大地加速了DNA片段分析技术的发展。自动化、高速、高通量成为新一代DNA 片段分析仪的基本要求。 DNA测序技术是现代分子生物学研究中最常用的技术，从1977年第一代测序技术的出现，经过30多年的发展,DNA测序技术取得重大进展，以高通量为特点的第二代测序技术逐步成熟并商业化,以单分子测序为特点的第三代测序技术也已经出现。本文介绍每一代测序技术的特点，并重点介绍了第二代测序技术及其应用。展望新的测序技术对于未来生物学研究及人们自身健康与人类疾病等方面研究的影响。
关键词: 第一代DNA测序技术 第二代DNA测序技术 第三代DNA测序技术 高通量
Abstract: DNA sequence analysis in modern biology and life sciences play an important role. Human Genome Project has greatly accelerated the development of DNA fragment analysis. Automated, high-speed, high-throughput DNA fragment analyzers a new generation of the basic requirements.As the commonly used technology in molecular biology,DNA sequencing technology has seen great advances in more than thirty years since 1977.Next-generation DNA sequencing technology, characterized by high-throughput, has entered the market and been growing tomaturity.The third-generation sequencing technology has also arisen,which can sequence single DNA moleculars. In this review,we introduced three generations of sequencing technologies and emphasized on the second-generation sequencing technology and its applications.At the end of the review, the effect of new DNA sequencing technologies on research and medicine were previewed.
Key words:First-generation DNA sequencing technology Second-generation DNA sequencing technology Third-generation DNA sequencing technology High-throughput technology
前 言
DNA测序技术是分子生物学研究中最常用的技术,它的出现极大地推动了生物学的发展。成熟的DNA测序技术始于20世纪70年代中期。1977年Maxam和Gilbert[1]报道了通过化学降解测定DNA序列的方法。同一时期, Sanger[2]发明了双脱氧链终止法。20世纪90年代初出现的荧光自动测序技术将DNA测序带入自动化测序的时代。这些技术统称为第一代DNA测序技术。最近几年发展起来的第二代DNA测序技术则使得DNA测序进入了高通量、低成本的时代。目前,基于单分子读取技术的第三代测序技术已经出现,该技术测定DNA序列更快,并有望进一步降低测序成本,改变个人医疗的前景。
随着生命科学的深入研究与生物技术的进一步发展,人们对探索自身研究自身的欲望在不断的加强。 对于生命现象和一些疾病的解释已经不再满足于目前单个基因位点的研究,越来越多的研究开始将目光集中于全基因组层面,特别是人类基因组计划顺利实施到完成以后,生命科学进入后基因组时代的今天,科学家们对于全基因组整体水平的研究需求越来越迫切。 尽管人类基因组计划取得了很大的成功,但当时的技术发展已经远远不能满足今天的需求,一方面是由于其高昂的费用,另一方面则是由于漫长的周期,为此发展全新的快速低成本的高通量测序技术已经势在必行。 自2005年Nature报道了454 life science公司一种最新的基于微乳液PCR技术的高通量测序技术以来[3] ,各大研究机构和生物公司竞相开展了高通量测序技术的研究工作。 在这些竞争中脱颖而出的有罗氏的454 测序技术平台、Illumina公司的Solexa测序平台[4]和AB I公司的SOL iD测序平台[ 5, 6 ] ,他们逐渐成为了新一代高通量测序技术的代表者。 时至今日新一代的测序技术或称之为下一代测序技术已经将人们带到了真正了高通量测序时代,这些技术也已经在许多领域得到了广泛的应用,尽管如此,高通量测序技术的发展的脚步并没有放慢,研究者们正朝着更高通量,更加准确,更加快速便宜的方向将高通量测序技术努力向前推进。现介绍DNA测序技术的发展历史及不同发展阶段各种主要测序技术的特点。
1 DNA测序技术的出现
早在DNA测序技术出现之前,蛋白质和RNA的测序技术就已经出现。1949年, Frederick Sanger[7]开发了测定胰岛素两条肽链氨基末端序列的技术,并在1953年测定了胰岛素的氨基酸序列[8, 9]。Edman[6]也在1950年提出了蛋白质的N端测序技术,后来在此基础上发展出了蛋白质自动测序技术[7]。Sanger等[8]在1965年发明了RNA的小片段序列测定法,并完成了大肠杆菌5S rRNA的120个核苷酸的测定。同一时期,Holley[9, 10]完成了酵母丙氨
酸转运tRNA的序列测定。
DNA测序技术出现的较晚, 1975年Sanger和Coulson[11]发明了“加减法”测定DNA序列。1977年在引入双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)后,形成了双脱氧链终止法,使得DNA序列测定的效率和准确性大大提高[2]。Maxam和Gilbert[1]也在1977年报道了化学降解法测定DNA的序列。DNA序列测定技术出现后,迅速超越了蛋白质和RNA测序技术,成为现代分子生物学中最重要的技术。
2 第一代DNA测序技术
传统的化学降解法、双脱氧链终止法以及在它们的基础上发展来的各种DNA测序技术统称为第一代DNA测序技术。第一代测序技术在分子生物学研究中发挥过重要的作用,如人类基因组计划(human genome projec,tHGP)主要基于第一代DNA测序技术。目前基于荧光标记和Sanger的双脱氧链终止法原理的荧光自动测序仪仍被广泛地应用。第一代DNA测序技术包括：化学降解法、双脱氧链终止法、荧光自动测序技术和杂交测序技术。
3 第二代DNA测序技术
随着人类基因组计划的完成,人们进入了后基因组时代,即功能基因组时代,传统的测序方法已经不能满足深度测序和重复测序等大规模基因组测序的需求,这促使了新一代DNA测序技术的诞生。新一代测序技术也称为第二代测序技术,主要包括罗氏454公司的GS FLX测序平台、Illumina公司的SolexaGenomeAnalyzer测序平台和ABI公司的SOLiD测序平台[20]。
第二代测序技术最显著的特征是高通量,一次能对几十万到几百万条DNA分子进行序列测序,使得对一个物种的转录组测序或基因组深度测序变得方便易行[21]。
新一代测序技术将片段化的基因组DNA两侧连上接头,随后用不同的方法产生几百万个空间固定的PCR克隆阵列。每个克隆由单个文库片段的多个拷贝组成。然后进行引物杂交和酶延伸反应。由于所有的克隆都在同一平面上,这些反应就能够大规模平行进行,每个延伸反应所掺入的荧光标记的成像检测也能同时进行,从而获得测序数据。DNA序列延伸和成像检测不断重复,最后经过计算机分析就可以获得完整的DNA序列信息[22]。其中包括：454测序技术、Solexa测序技术和SOLiD测序技术。
3·4 第二代测序技术的应用
3·4. 1 从头测序(de-novo sequencing) 对于基因组未被测序过的生物,其基因组测序需要从头测序。由于受测序读取长度的,新一代测序技术中只有454技术能完成复杂基因组如真核生物基因组的从头测序工作。Solexa和SOLiD技术只能完成简单生物如细菌的基因组的从头测序。在复杂基因组的从头测序中,将Solexa/SOLiD与454技术或传统的Sanger测序技术结合,分别利用它们的高通量和较长读长的优势,可以大大降低测序成本,提高测序速度。如最近完成的黄瓜全基因组测序,就联合运用了Solexa技术和Sanger技术,得到平均72·2倍覆盖度的黄瓜基因组序列,其中3·9倍是用Sanger技术得到的, 68. 3倍是用Solexa的GA测序平台得到的[31]。
3·4. 2 重测序 如果对照一个参考基因组,新一代测序技术可以短时间内非常轻松的完成一个基因组的重测序。2008年,由中国、美国和英国共同启动的千人基因组计划(1000 GenomesProject)是人类基因组计划的延续,也是迄今为止最大的基因组重测序计划。该计划打算测序大约1 200个全世界不同国家的人类个体的基因组。454、ABI和Illumina共同加入该计划[32]。
3·4. 3 SNP研究 SNP全称是Single Nucleotide Polymorphism,意即单核苷酸多态性,是指不同个体的基因组上单个核苷酸的变异,包括替换、缺失和插入。SNP在基因组中分布相当广泛,一般来说, SNP是指变异频率大于1%的单核苷酸变异。SNP可以作为新的遗传标记,人体许多表型差异、对药物或疾病的易感性等等都可能与SNP有关。研究SNP是人类基因组计划走向应用的重要一环,因为SNP将提供一个强有力的工具,用于高危群体的发现、疾病相关基因的鉴定、药物的设计和测试以及生物学的基础研究等[33, 34]。新一代测序技术利用其高通量、低成本的优势,对较多的个体测序,很容易可以得到大量的SNP位点。千人基因组计划即可得到众多的人类基因组SNP位点。其它的在SNP研究中的应用如利用Solexa测序技术对线虫CB4858品系进行重测序,寻找线虫(Caenorhabditis elegance)基因组中的SNP位点[35],以及寻找橄榄型油菜(Brassica napus)转录组(transcriptome)中的SNP位点[36]等。
3·4. 4 转录组及表达谱分析 基因表达谱(gene expression profile)指细胞在特定的条件下表达的所有基因。分析基因表达谱是了解组织或器官行使功能的分子基础及环境和病变影响生物的分子机制等的重要手段。以往的基因表达谱分析主要依靠基因芯片技术,该技术需要依赖已知的基因序列来设计探针,通过荧光标记和杂交,根据荧光的强度计算表达量的多少,误差较大,而且无法检测未知基因的表达量。第二代测序技术可对单个细胞样品中的所有RNA即整个转录组进行整体测序,对每个细胞中表达1-50 000个拷贝mRNA的基因都能够检测,该技术还可以检测以前没发现过的基因或新的转录本(transcript),定量测定基因的表达模式[37]。如Mortazavi等[38]利用Solexa技术对小鼠的大脑、肝脏和骨骼肌进行了RNA测序,对测得的每条序列进行计数从而获得每个特定转录本的表达量,能检测到丰度非常低的转录本。分析测得的序列,至少有3 500个基因拥有不止一种剪切形式,其中有接近10%是从未被报道过的RNA的剪切形式。同年Sugarbak-er[39, 40]利用mRNA深度测序对恶性胸膜瘤和对照样品进行比较,发现了肿瘤细胞基因组中存在的15个不同的点突变。
3·4. 5 小分子RNA(miRNA)研究第二代测序技
术还被广泛应用于小分子RNA(microRNA,miRNA)或非编码RNA(ncRNA)表达研究。非编码的小分子RNA参与了许多重要的生物发育过程[41]。它们的序列长度很短,只有18-40个核苷酸,正好在新一代高通量测序技术的读长范围内。第二代测序方法还能发现新的小分子RNA。如利用Illumina的新一代测序技术对人胚胎干细胞发育前后的分析,获得了334个已知的和104个新发现的小RNA的表达谱[42]。
3·4. 6 转录研究(ChIP-seq)染色体免疫共沉淀(chromatin immunoprecipitation,ChIP)技术是研究蛋白-DNA相互作用的重要方法。以往的研究需结合芯片技术(即ChIP-on-chip或ChIP-chip),因为芯片技术基于杂交原理,需根据已知的序列设计探针,对于未知的序列为力。把ChIP技术和第二代测序技术结合,即ChIP-sequencing(ChIP-seq),可以在基因组水平上很方便的检测某种蛋白所结合的DNA序列,全面了解蛋白与DNA的相互作用。如2009年Ouyang等[43]利用ChIP-seq技术发现,在小鼠胚胎干细胞中,大约有65%的基因表达是由12
个转录因子的。
4 第三代DNA测序技术
4.1 第二代测序技术以其高通量、低成本的优势,很快得到了广泛的应用。最近,以单分子测序为特点的第三代DNA测序技术已经出现,如生物科学公司(BioScience Corporation)的HeliScope单分子测序仪(HeliScope SingleMolecular Sequencer)[44, 45]以及正在研制的太平洋生物科学公司(Pacific Biosciences)的单分子实时DNA测序技术[SingleMolecule Real Time (SMRT)DNA sequencing technology][46]和牛津纳米孔技术公司(Oxford Nanopore TechnologiesLtd)的纳米孔单分子测序技术[47]等[48, 49]。斯坦福大学的科学家最近利用Heliscope单分子测序仪,用了48 000美元的试剂和4个星期的时间,对一名白人男子的基因组进行了测序。测序的覆盖度达28倍,覆盖了90%的人类参考基因组。序列读长24-70 bp,平均读长为32 bp,并鉴定出280万个SNP位点和752个拷贝数变异[55]。目前,我国也启动了第三代测序技术的研究。2009年12月,中科院北京基因组研究所与浪潮成立“中科院北京基因组研究所—浪潮基因组科合实验室”,利用各自的优势联合研发国产第三代测序仪,第一台样机预计2013年问世,届时有望缓解测序仪核心技术受制于国外公司的现状。
4.2 高通量测序技术的发展趋势
新一代的高通量测序技术已经得到了很好的发展和应用,在这代技术的协助下,个人版的基因组图谱正在如火如荼的绘制中。但是由于其测序速度、成本、准确度等关键问题的解决仍存在困难,研究者们很快将目光转向了更高更新的测序解决方案。 单分子测序也就应运而生,目前单分子测序作为更新一代的技术也已经有了较好的发展,各大科研团队和公司已经相继提出了自己的想法并推出了各自的仪器和技术平台,其中比较被大家所看好的主要有Helico BioScience、Pacific的单分子测序技术和基于纳米孔的测序技术[ 5, 6, 28, 29 ] 。 2008年4月Helico BioScience公司的Timothy等人在Science上报道了他们开发的真正的单分子测序技术,并利用该技术对一个M13病毒基因组进行重测序[ 30 ] 。 这项技术之所以被称为真正的单分子测序,是因为它完全跨过了上述3种高通量测序依赖的基于PCR扩增的信号放大过程,真正达到了读取单个荧光分子的能力。Pacific bioscience 在Science上报道了他们的基于SMART技术的单分子测序技术[ 31 - 33 ] ,该技术利用单分子技术和DNA聚合酶,在聚合反应的同时就可以读取测序产物,目前一期的读取速度为3bp / s,但他们声称在2013 前实现三分钟读完人类基因组。Pacific技术目前在研究大肠杆菌基因组时的评价读长为586个碱基,有些能达到2805碱基,新仪器的单个读长已达10351个碱基,而且有望实现更大的读长,而且其准确率大于99.9999%。 英国牛津纳米公司成功研制出了基于纳米孔的单分子测序技术,该技术读取数据的速度更快,而且成本会大大降低[ 50-54 ] 。 在该测序技术平台中,DNA分子以一次一个碱基的速度依次通过纳米小孔,利用核酸外切酶的特性来识别出不同的DNA碱基,同时还能检测出碱基是否被甲基化等相关的重要信息。
4.3 探测单个DNA 分子技术开启高通量DNA 电子测序之门
据2010 年7 月30 日Xiao Yan（Nano Lett，July 30，2010）报道，美国宾夕法尼亚大学的研究人员开发出一个纳米级的碳基平台，可用于电子探测单个DNA 分子。该技术最终有望在快速DNA 电子测序方面发挥“用武之地”。这个纳米平台由石墨烯制成。研究小组利用电子束技术，在石墨烯膜上烧灼出纳米大小的小孔，在电场的作用下，微小的DNA链就可以穿过这些孔洞。通过电子测量手段检测DNA 的易位，再根据DNA 的4 个碱基各自独特的“电子签名”，就可以快速完成DNA 测序。实验中，研究人员使用化学气相沉积法培育出大块的石墨烯薄片，并将这些薄片悬停在一个氮化硅制成的微米孔的上方，然后借助透射电子显微镜发出的电子束，在石墨烯薄片的中心钻出一个更小的纳米孔。这些固态的纳米孔为在单分子水平上进行的生物学检测提供了宝贵的工具。石墨烯是由单一碳原子层构成的二维结构材料，由于石墨烯层的厚度小于DNA 两个碱基之间的距离，因此石墨烯纳米孔设备可望具有高分辨率。石墨烯材料此前就已经被用于制造其他的电子和机械装置，但迄今尚未被用于检测DNA 的易位。
这种石墨烯纳米孔设备的工作方式非常简单。纳米孔将两种电解质溶液分隔开来，施以电压，溶液中的离子就可以穿过纳米孔。离子的流动情况可以通过电流的大小来检测。如果将DNA 分子注入到电解质溶液中，单个的分子同样可以通过纳米孔。当DNA 分子发生易位时，它们会阻断离子的流动，这种情况可以通过电流变小来判断。由于DNA 的4 个碱基阻断电流的能力各异，很容易通过这种石墨烯纳米孔设备加以区分，从而有望使低成本、高通量的DNA 测序技术变为现实。此外，为了使石墨烯纳米孔设备更加经久耐用，研究人员还在石墨烯层之上覆盖了一个只有几个原子层厚的超薄氧化钛层，从而形成了一个更洁净、更易湿润的表面，使DNA 更容易穿过，同时帮助降低了纳米孔的噪声水平。目前，研究人员正在着手改善这些设备的整体可靠性，并希望利用石墨烯层的导电性来研制可横向电子控制DNA 易位的装置。具体来说，这种横向电子控制可以通过将石墨烯蚀刻成纳米电极来实现。而早在2008 年，研究人员就已经证明，石墨烯可以通过纳米蚀刻技术雕琢成任意结构，如纳米带、纳米孔和其他形状等，从而为未来的应用打下了坚实基础。
5 展望
DNA测序技术经过30多年的发展,目前已经到了第三代,三代测序技术有各自的优势。第一代测序技术虽然成本高,速度慢,但是对于少量的序列来说,仍是最好的选择,所以在以后的一段时间内仍将存在;第二代测序技术刚刚商用不久,正在逐渐走向成熟;第三代测序技术有的刚刚出现,有的则正在研制,相信很快便可进行商业化运作。可以预见,在未来的几年里会出现三代测序技术共存的局面。随着新的测序技术的出现,大规模测序的成本迅速下降,花费1 000美元测一个人的基因组的目标相信很快就可以实现。届时,对于遗传病的诊治将变得简单、快速,并能从基因组水平上指导个人的医疗和保健,从而进入个人化医疗的时代。同时,生物学研究的进展将会更多地依赖于测序技术的进步,不同领域的科学家花很少的钱就可以对自己熟悉的物种基因组进行测序,从而更好地指导试验设计,取得更多新的发现。在进入后基因组时代的今天,基因测序工作仍然与我们密切相关,因为蛋白质组仅能告诉我们疾病的分子症状,而基因才是引发疾病的根本原因。 若要进行疾病预测,则疾病敏感基因的鉴定就必不可少。 只有综合运用遗传学,蛋白组学,转录组学和代谢组学才能推动我们想个体化医疗前进。 科学往往是在技术的竞争中发展进步的,高通量测序技术的发展亦是如此,随着第三代测序技术的发展,相信诸如个体化医疗等诸多生命科学与医学问题的解决很快就能真正的实现。
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