一．实验目的

1、学习从土壤中分离、纯化微生物的原理与方法。

2、学习、掌握微生物的鉴定方法。

3、对提取的土样进行微生物的分离、纯化培养，并进行简单的形态鉴定

4、对简单鉴定后的微生物进行生理生化鉴定并由鉴定结果查伯杰氏手册以确定分离出微生物的品种。

二. 实验原理

α-淀粉酶是一种液化型淀粉酶，它的产生菌芽孢杆菌，广泛分布于自然界，尤其是在含有淀粉类物质的土壤等样品中。

      从自然界筛选菌种的具体做法，大致可以分成以下四个步骤：采样、增殖培养、纯种分离和性能测定。

1、采样：即采集含菌的样品

   采集含菌样品前应调查研究一下自己打算筛选的微生物在哪些地方分布最多，然后才可着手做各项具体工作。在土壤中几乎各种微生物都可以找到，因而土壤可说是微生物的大本营。在土壤中，数量最多的当推细菌，其次是放线菌，第三霉菌，酵母菌最少。除土壤以外，其他各类物体上都有相应的占优势生长的微生物。例如枯枝、烂叶、腐土和朽木中纤维素分解菌较多，厨房土壤、面粉加工厂和菜园土壤中淀粉的分解菌较多，果实、蜜饯表面酵母菌较多；蔬菜牛奶中乳酸菌较多，油田、炼油厂附近的土壤中石油分解菌较多等。

2、增殖培养（又称丰富培养）

增殖培养就是在所采集的土壤等含菌样品中加入某些物质，并创造一些有利于待分离微生物生长的其他条件，使能分解利用这类物质的微生物大量繁殖，从而便于我们从其中分离到这类微生物。因此，增殖培养事实上是选择性培养基的一种实际应用。

3、纯种分离

在生产实践中，一般都应用纯种微生物进行生产。通过上述的增殖培养只能说我们要分离的微生物从数量上的劣势转变为优势，从而提高了筛选的效率，但是要得到纯种微生物就必须进行纯种分离。纯种分离的方法很多，主要有：平板划线分离法、稀释分离法、单孢子或单细胞分离法、菌丝尖端切割法等。

三．实验材料

1、器材：

小铁铲和无菌纸或袋（可省）、培养皿8个、载玻片、盖玻片、普通光学显微镜、量筒、滴管、吸水纸、无菌水试管5支（每支4.5mL水）、烧杯3个、三角瓶5个、电炉、玻璃棒、接种环、镊子、恒温培养箱、高温灭菌锅、移液（头10个）、天平、滤纸、pH试纸等。

2、试剂：

配制牛肉膏蛋白胨培养基的原料（牛肉膏0.9g、NaCl1.5g、琼脂4.5g、蛋白胨3.0g）、Lugol氏碘液、可溶性淀粉0.6g、结晶紫染液、番红染液、95％乙醇、无菌水等。

3、土样：取自桂林师专甲山校区药用植物园面的土壤，地下10cm左右。

四．实验方法步骤

1、采集土样  带上小铁铲和无菌袋到土豆地采集较细碎土壤

2、样品稀释  在无菌纸上称取样品1g，放入100mL无菌水的三角瓶中，手摇10分钟使土和水充分混合。用1mL无菌吸管吸取0.5mL注入4.5mL无菌水试管中，梯度稀释至10-6。

3、分离  用稀释样品的同支吸管分别依次从10-6、10-5、10-4样品稀释液中，吸取lmL，注入无菌培养皿中，然后倒入灭菌并融化冷至50℃左右的固体培养基，小心摇动冷凝后，倒置于37℃温箱中培养48小时。培养基的配制—称取蛋白胨 1.0g； NaCl  0.5g； 牛肉膏 0.3g；琼脂1.5g；pH6.4左右；100ml水定容。

          4、初步鉴定  对多种菌进行形态特征的观察，简单染色、革兰氏染色以及芽孢染色观察，记录结果。

5、α-淀粉酶鉴定

          1)实验原理：

细菌能否产生α-淀粉酶主要依据是鉴定有能否分解淀粉。α-淀粉酶该酶可以把淀粉分解，因淀粉遇碘变蓝色，如菌落周围有无色圈，说明该菌能分解淀粉

           2)步骤：

          将培养的的各种待测菌种接种在含有2%淀粉液的牛肉膏蛋白胨培养基中，培养基的配制—称取蛋白胨 1.0g； NaCl  0.5g； 牛肉膏 0.3g； 可溶性淀粉0.2g；琼脂1.5g；pH6.4左右；100ml水定容（注：先将可溶性淀粉加少量蒸馏水调成糊状，再加到溶化好的培养基中，调匀），倒置于37℃温箱中培养18-24小时后，取出平板，向皿中注入l滴Lugol氏碘液，因淀粉遇碘变蓝色，如菌落周围有无色圈，说明该菌能分解淀粉。

6、 纯化  从平板上选取淀粉水解圈直径与菌落直径之比较大的菌落，用接种环沾取少量培养物至斜面上，并进行2-3次划线分离，挑取单菌落至斜面上，培养后观察菌苔生长情况并镜检验证为纯培养。

性能测定

分离得到纯种这只是选种工作的第一步。所分得的纯种是否具有生产上所要求的性能，还必须要进行性能测定后才能决定取舍。性能测定的方法分初筛和复筛两种。

初筛一般在培养皿上根据选择性培养基的原理进行。例如要测定淀粉酶的活力可以把斜面上各个菌株一一点种在含有淀粉的培养基表面，经过培养后测定透明圈与菌落直径的比值大小来衡量淀粉酶活力的高低。下载本文