作者简介：曹永红，女，副主任药师 研究方向：临床药学 Tell ：(0773)3832001 E-mail ：cyh60@163.com

硫普罗宁稳定性与不良反应相关性的实验研究

曹永红1，杨辉2，李革晖1，汪江波1（广西壮族自治区南溪山医院药剂科，广西 桂林 541002，2. 广西南宁食品药品检验所，南宁 530001）

摘要：目的 通过动物实验，研究注射用硫普罗宁在输液中的稳定性与实验大鼠发生药物不良反应的关系。方法 将注射用硫普罗宁与5%葡萄糖注射液在25 ℃按标准操作配伍后放置12 h ，观察其外观变化；采用酸度计、微粒分析仪分别观察上述样本的pH 值、不溶性微粒数的变化情况；用高效液相色谱仪测定样本中硫普罗宁的含量；将样本溶液经静脉注入实验大鼠体内，观察大鼠的反应，并记录大鼠血压变化情况；取全血测定大鼠血清中特异性抗体IgE 及嗜酸性粒细胞的值。结果 配伍液在12 h 内外观、pH 值无明显变化，不溶性微粒项符合《中国药典》规定。硫普罗宁含量在放置3，6 h 下降值大于15%，放置12 h 含量下降36.2%。动物实验显示，6，12 h 组在给药10 min 时平均动脉压与对照组比较，均有显著性差异(P <0.05）。12 h 组的IgE 值与对照组比较有显著性差异(P <0.05）。结论 硫普罗宁与5%葡萄糖注射液配伍后放置时间越长，稳定性越差，导致大鼠发生不良反应的机率增大。 关键词：硫普罗宁；稳定性；不良反应

中图分类号：R965 文献标识码：A 文章编号：1001-2494(2009)11-0842-04

Study on Relationship Between the Stability of Tiopronin and Adverse Reaction

CAO Yong-hong 1，

YANG Hui 2，LI Ge-hui 1，W ANG Jiang-bo 1(1. Pharmacy of Nanxi Hill Hospital of Guangxi Zhuang Autonomous Region ，Guilin 541002，China ；2. Nanning Institute for Food and Drug Control ，Nanning 530001，China ）

ABSTRACT ：OBJECTIVE To study the relationship between the stability of tiopronin for injection diluted after reconstitution and the adverse reactions in rats. METHODS Tiopronin for injection was with 5% glucose injection to make compatibility solution with the standard operation at 25 ℃. After 12 h ， the change of its appearance was observed. The pH ，the amount of insoluble particles were determined by the acid measurer and the particular analysis apparatus respectively. The content of tiopronin in the samples was measured by the high performance liquid chromatograph. The sample solutions were injected into the vein of rats. Then the response of rats was observed and the changes of blood pressure was measured. The specific antibody IgE and the amount of Eosinophil granulocyte in rat serum were determined. RESULTS The appearance and pH value of compatibility solution had no obvious change within 12 h ，and the item of insoluble particles met the requirements of Chinese Pharmacopoeia. Tiopronin content decreased by more than 15% after 3 and 6 h ， while it decreased by 36.2% after 12 h. The mean arterial blood pressures, in 6 h group and the 12 h group at 10 minutes after administration ，compared with that of the control group ，were significant different (P <0.05）. The IgE level of the 12 h group ，compared with that of the control group ，were significant different (P <0.05）. CONCLUSION The longer the compatibility liquor of Tiopronin and 5% glucose injection is shelved ， the poorer the stability is. It leads to higher probability of the adverse reactions of the rats. KEY WORDS ：tiopronin ；stability ；adverse reaction

硫普罗宁（tiopronin ，商品名：凯西莱，简称TPN ）

，化学名：N-(2-巯基丙酰基)-甘氨酸，为20世纪60年代日本研制的一种新型含游离巯基的甘氨酸衍生物，其侧链上的游离巯基被认为是人体新陈代谢的保护剂[1]，多年来主要作为一种肝功能改善剂应用于临床。随着TPN 在临床的广泛应用，对其不良反应的研究报道也渐增多。TPN 引起的不良反应以过敏性休克为多见，速发型占多数，发生程度较重，反应属I 型变态反应，难以监控。国内的临床研究报告TPN 的不良反应发生率仅为

3.5%~17% [2]，而国外因TPN 的不良反应而停药者可高达24%～40% [3]。目前，关于TPN 引起的不良反应的机制尚不清楚。

本实验旨在通过考察TPN 与5%葡萄糖注射液配伍后的稳定性指标：外观、pH 值、不溶性微粒数及含量的变化情况，以及给药后实验大鼠的血压、IgE 及嗜酸性粒细胞 (EOS ）值的变化情况，评价TPN 在输液中的稳定性与其所至不良反应的关系，为规范临床操作及保证临床安全用药提供实验依据。

1.1动物

洁级SD大鼠90只，体重180～200 g，雌雄各半（广西医科大学医学实验动物中心）。

1.2药物

注射用硫普罗宁（河南省新谊药业股份有限公司，批号 070302-2），5%碳酸氢钠注射液（河南省新谊药业股份有限公司，批号 070302-2，专用溶媒），5%葡萄糖注射液（上海华源长富药业有限公司，批号06101902）。0.9%氯化钠注射液（徐州莱恩药业有限公司，批号 0704052）。

1.3试剂与仪器

硫普罗宁对照品[广西南宁食品药品检验所化学室精制纯化，含量99.8%（g/g）]，甲醇为色谱纯，磷酸等试剂均为分析纯。实验用化学试剂均按《中国药典》（2005年版）一部附录项下方法配制。SPD-10AVP型高效液相色谱仪（日本岛津公司），威玛色谱数据工作站；AE240电子天平[梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司]；Delta320 pH计[梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司]；ZWF-J6激光注射液微粒分析仪（天津天河医疗仪器有限公司）；BL-410生物机能实验系统（成都泰盟科技有限公司）；日本SYSMEX XT-1800i血流分析仪；EOS试剂[SYSMEX（希森美康）公司，批号A7052]；美国WELLSCAN WK3酶标仪，IgE试剂（美国E＆E Labs，批号07823）。

2方法

2.1对照品溶液制备

精密称取经干燥至恒重的TPN对照品20 mg，置50 mL量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，经微孔滤膜（0.45 µm）过滤后制成对照品溶液备用。

2.2供试品溶液的制备

精密称取TPN 100 mg，置250 mL量瓶中，加专用溶媒2 mL（5%的碳酸氢钠，pH为7.5～8.5）溶解，再加入5%葡萄糖注射液至刻度，摇匀，经微孔滤膜（0.45 µm）过滤后制成供试品溶液备用。

2.3检测波长的选择

取TPN对照品适量，加流动相制成含TPN 30 mg·L-1的溶液，同时配制空白溶液，在200～300 nm 波长处扫描，在205 nm处有最大吸收，故本实验选择205 nm为本品的检测波长。2.4流动相选择

甲醇-水（5∶95）用磷酸调至pH 2.5。TPN 化学性质偏酸性，故采用酸性离子抑制色谱法，以磷酸调节流动项的pH值为酸性以起到使TPN 以分子态存在，若pH值控制不当，溶液以分子态和离子态共存则可能使色谱变宽或拖尾。根据文献[4-6]报道的流动相进行筛选，结果显示，以甲醇-水（5∶95）用磷酸调pH至2.5做流动相优于以乙腈-水（10∶90），用醋酸调节pH值至3.5和以乙腈-水（93∶7），用磷酸调节pH值至2.2做流动相。测定波长为205 nm，出峰时间约10 min，基线稳定，对照品与样品中其他组份达到基线分离。

2.5色谱条件

色谱柱Phenomenex C18（4.6 mm×250 mm，5 µm）；柱温：室温；流速：1.0 mL·min-1；检测波长：205 nm；进样量：20 µL。

2.6线性关系考察

精密称取在105 ℃干燥至恒重的TPN对照品250 mg，置50 mL量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀；分别精密吸取上液，用流动相稀释，配制成系列质量浓度0.10，0.25，0.50，0.75，1.00 mg·L-1的对照品溶液，分别精密吸取20 µL，注入液相色谱仪，按“2.1.5”色谱条件进行测定，以峰面积积分值（A）为纵坐标，进样质量浓度（ρ）为横坐标进行线性回归，绘制标准曲线。回归方程为A=1.5×104ρ+316（r=0.999 7，n=5），进样量在0.1～1.0 mg内与峰面积比线性关系良好。

2.7不溶性微粒检测

取放置不同时间的供试品溶液，翻转20次，使溶液混匀，立即小心开启容器，先倒出部分供试液冲洗开启口及取样杯，将供试液倒入取样瓶中，超声处理（80～120 W）30秒脱气或静置于取样器中，依法[7]测定。

2.8建立肝损伤大鼠模型

将90只健康SD大鼠随机分成6组，按文献[8]方法进行造模。于第5周末，从造模组随机抽取3只大鼠，经腹主动脉抽血后处死，剖取肝脏，作肝组织普通切片（病检）；测定大鼠血清ALT（谷丙转氨酶）、AST（谷草转氨酶）、TP（总蛋白）、ALB （白蛋白）值。结果显示，3只大鼠ALT，AST，TP，ALB值均超过正常值范围；肝脏病变基本相似，主要为广泛肝细胞水肿变性、部分肝细胞气球样

变；肝细胞点状坏死；汇管区多少不等炎细胞浸润。符合慢性肝组织炎症改变，造模成功。 2.9 实验观察项目及方法

将存活的肝损伤模型大鼠49只随机分为7组，每组各7只，0组为对照组，予生理盐水注射液3 mL·kg -1做对照实验，其余6组为实验组1，2，3，4，5，6。各实验组分别予配制后放置0，0.5，1，3，6，12 h 的硫普罗宁葡萄糖注射液4.46 mL·kg -1注入大鼠静脉，观察各组大鼠的反应，测量大鼠在0，5，10 min 时的血压，然后取血测定大鼠血清中IgE 及EOS 的值，对所得结果进行分析。 2.10 统计学处理

用PEMS 3.1统计软件对实验结果进行处理。计量资料两组间比较用t 检验，计数资料用x 2检验。

3 结 果

3.1 TPN 与5%葡萄糖注射液配伍后的稳定性

配伍液在放置0，0.5，1.0 h 后测得的含量无明显变化；放置3，6 h 后测得的结果与对照品相比含量均下降15%以上；放置12 h 后测得的结果与对照品相比含量下降36.2%。见表1。配伍液在放置12 h 后其外观、pH 值无明显变化；不溶性微粒数符合《中国药典》（2005年版）规定。见表2。

3.2 配伍液对实验大鼠各指标的影响

将放置不同时间的配伍液经静脉注入大鼠体内后测得平均动脉压（MAP ）结果显示，给药前与给药5 min 时测得各组实验大鼠MAP 值与对照组

表1 放置不同时间对TPN 含量的影响 Tab.1 Content of TPN after reconstitution

t / h Content/%

Reference 99.8

0 99.52

0.5 97.19

1 94.69 3 83.73 6 82.24

12 63.32

表2 配伍液放置不同时间对pH 值、不溶性微粒数的影响

Tab.2 pH Value and insoluble particles account of compatibility solution at different time

Insoluble particles amount t / h

pH Value

≥10 µm·mL -1

≥25 µm·mL -1

0 7.46 0.30 0.00 0.5 7.47 0.40 0.00 1 7.49 0.20 0.10 3 7.52 1.90 1.60 6 7.54 2.00 1.60 12 7.56

1.90

1.60

相比无显著差异；实验5组、6组在给药10 min 测得大鼠MAP 值与对照组比较，存在显著性差异（P <0.05），其余各组与对照组比较无差异。见表3。各实验大鼠EOS 和IgE 检测结果显示，除实验6组的大鼠血清IgE 值与对照组比较存在显著性差异（P <0.05），其余各组与对照组比较无差异；各实验组的EOS 值与对照组比较均无显著性差异（P ＞0.05）。见表4。

4 讨 论

4.1 TPN 与输液配伍后稳定性情况

实验结果表明，随着配伍液放置时间延长，TPN 的含量发生了很大改变。经3 h 放置后其含量由0 h 时的99.5%下降至83.73%；放置12 h 后含量仅为63.32%。因TPN 化学结构中含巯基，具有易氧化性，由此我们推断，导致TPN 配伍液含量迅速降低的原因，可能与该药在放置时逐步发生氧化反应有关。反应所生成的物质化学结构不明，在本实验条件下并未检测到杂质峰。从TPN 结构分析，其氧化产物可能是小分子的物质，因此，配伍液在放置不

表3 配伍液放置不同时间对大鼠MAP 的影响. ±x s Tab.3 Influence of tiopronin after reconstitution at different time on the MAP of rats. ±x s

MAP/MMHG

Group

Amount of animals

Before administration

5 min after administration

10 min after administration

0 6 170.15±35.88 1.37±31. 190.84±27.82 1 6 147.95±61.40 126.38±.75 147.35±53.47 2 6 151.95±.20 179.65±51. 160.11±40.08 3 7 165.37±39.29 183.25±36.01 175.17±37.65 4 6 145.71±52.91 168.30±47.99 1.52±50.22 5 5 150.83±53.16 159.00±15.27 140.73±12.121) 6 6 152.72±24.97 149.60±21.77 128.29±10.901)

注：实验组与对照组比较，P <0.05

Note ：the experimental groups compared with the control group ，1)P <0.05

表4 配伍液放置不同时间对大鼠EOS 和IgE 的影响.

±x s

Tab.4 Influence of tiopronin after reconstitution at different on the EOS and IgE of rats. ±x s

Group

Amount of animals

EOS

IGE 0 6 0.6±0.32 0 1 6 1.08±0.49

2 5 0.68±0.92 3.75±7.1

3 3 7 1.07±0.73 0.39±0.50

4 6 0.95±0.93 0

5 5 0.84±0.71 0

6 6 0.82±0.70 0.59±0.241)

注：与对照组比较，1)P <0.05

Note ：The experimental groups compared with the control group ，1)P ＜0.05

4.2大鼠出现不良反应与TPN配伍液放置时间的关系

硫普罗宁不良反应主要表现为过敏性休克[9]，血压下降是过敏性休克主要表现之一。大鼠血压正常值范围为13.04（10.90～15.95）/10.10（7.97～11.96）kPa[10]。实验结果显示，随着TPN配伍液放置时间的延长，经静脉给药后，其对大鼠血压的影响越大。实验中还发现有多只大鼠在给药后3~5 min，出现躁动，抽搐，心律不稳，血压降低，其中一只在4 min后死亡。当实验大鼠自身血压低于正常值时上述表现更明显。TPN引起的变态反应在较短时间即出现，与文献[11]报道相一致。

由IgE-介导的过敏性反应是变态反应最严重的形式[12]。血清中IgE抗体及EOS值是变态反应的特异性指标。实验观察各组大鼠在给药后均未出现明显的皮肤过敏现象。随着配伍液放置时间延长，大鼠血清IgE、EOS值并未出现很明显的变化，仅是实验第6组的血清IgE值与对照组有差异。个别大鼠EOS值略有增高，但并无统计学意义。由此可见，TPN引起的过敏反应与IgE抗体有关，可能与EOS关系不大。

通过本实验我们认为，TPN按药品说明书要求与5%葡萄糖注射液配伍后，随着放置时间的延长，含量下降迅速，导致大鼠发生不良反应的机率增大。实验结果对临床安全合理使用TPN具有一定的参考价值。

致谢：桂林医学院药理教研室徐庆教授在动物实验方面给予了大力帮助。

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（收稿日期：2008-07-07）

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