广东海洋大学 农 学 院 10级 农资 罗洋 6398

广东海洋大学 水产学院 10级 海科 苏行 697933

广东海洋大学 水产学院 10级 海科 张敏 657451

摘        要

在日常生活中，面食是我们不可或缺的食品。然而值得我们注意的是：同样是面食，可发酵后的馒头、面包就比大饼、面条等没有发酵的食品营养更丰富。研究证明，酵母不仅改变了面团的结构，让它们变得更松软好吃，还大大地增加了馒头、面包的营养价值。单就面粉中的蛋白含量来说，发酵前后其增量接近2倍。该实验的目的即在：通过“双缩脲法”及“凯氏定氮法”来测定面粉发酵前后的蛋白含量差异来论证酵母发酵的优越性，并加以推广。

关键词：酵母发酵  蛋白含量  双缩脲法  凯氏定氮法

1、前言  

    面粉的发酵方式有小苏打发酵、老面发酵、酵母发酵等，但除了酵母发酵外其他方法均有不利之处。本实验作为验证性实验即通过测定面粉发酵前后的蛋白含量差异来论证酵母发酵的优越性。由于发酵前后面粉的理化性质不同，故此实验可分为两个部分：1，未发酵的干燥面粉可以溶于有机溶剂四氯化碳所以采用“双缩脲法”来测定其蛋白含量。2，发酵后的面粉呈糊状，无适当的试剂来将其溶解，故此处采用“凯氏定氮法”测量其蛋白含量。

2、实验目的  

    测定未发酵及发酵过的面粉的蛋白含量，比较其差异值。来证明酵母的发酵优良性。

3、实验原理  

    3.1  双缩脲（NH2CONHCONH2）是两个分子脲经180℃左右加热，放出一个分子氨后得到的产物。在强碱性溶液中，双缩脲与CuSO4形成紫色络合物，称为双缩脲反应。凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键，或能过一个中间碳原子相连的肽键，这类化合物都有双缩脲反应。在一定的浓度范围内，紫色络合物颜色深浅与蛋白质含量呈线性关系（即：颜色的深浅与蛋白质浓度成正比）而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关，故可在540nm处比色用来测定蛋白质含量。测定范围为1－10mg蛋白质/ml。干扰这一测定的物质主要有：硫酸铵、Tris缓冲液和某些氨基酸等。

此法的优点是较快速 ，不同的蛋白质产生颜色的深浅相近，以及干扰物质少。

3.2  面粉与硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，分解的氨与硫酸结合生成硫酸铵。然后碱化蒸馏使氨游离，用硼酸吸收后再以硫酸或盐酸标准溶液滴定。通过反应耗酸的体积即可得出样品中的蛋白含量。反应装置如图1所示：　

4、实验设备  

1.试管 ×  8    

2.移液管 × 4    

    3.分光度计     

4.摇床    

5.高速离心机    

6.凯氏定氮仪    

7.电炉    

8.消化架

9.锥形瓶100ml  × 3  

10.100ml量筒 

11.酸式滴定管

12、凯氏烧瓶50m l× 3  

13、小漏斗× 3        

14、玻璃珠      

15、烧杯50ml(X 1)

5、实验材料及试剂

1、干燥小麦面粉    

2、四氯化碳

    3、优质酵母    

4、浓硫酸（A.R)

5、双缩脲试剂：取 1.5g 硫酸铜（CuSO4·5H2O)溶于500ml蒸馏水中,搅拌加入300ml的10％NaOH,用水稀释至l000ml。

    6、标准液：10mg/ml酪蛋白溶液

    7.硫酸钾—硫酸铜混合物：硫酸钾3份与硫酸铜1份（质量比）混合研成粉末

    8、50%NaOH溶液：50gNaOH溶于蒸馏水，稀释至100ml。

    9、2%的硼酸溶液：2g溶于蒸馏水，稀释至100ml。

    10、混合指示剂：0.1%甲基红乙醇溶液和0.1%甲烯蓝乙醇溶液按体积比4:1混合。

    11、0.01mol/L标准盐酸溶液：用恒沸盐酸准确稀释。

6、实验操作步骤

6.1  双缩脲法测定未发酵面粉的蛋白含量

    6.1.1  标准曲线的制作。酪蛋白：10mg/ml（以下表为准进行配制，测定，绘图），计算出各管浓度（计算出各管浓度，再做标准曲线，）

混匀，放置30分钟后，在540nm处以1号管调0点，测定各管吸光度，以吸光度（OD值）为纵坐标，蛋白质浓度（酪蛋白的毫克数）为横坐标绘制标准曲线。

    6.1.2  0.25g小麦面粉＋0.5ml四氯化碳＋25ml双缩脲试剂（四氯化碳为有机溶剂，在这里作为分散剂，使面粉不成团。）；

    6.1.3  加塞，在摇床上振摇30分钟，使之充分混匀、反应，然后于实验台上静置10分钟；

    6.1.4  离心，4000rPm，离心15分钟；

6.1.5  取上清比色：OD 540 nm；（在用滴管取上清时要轻、缓，避免沉淀物上浮。对照管是以介质溶液调零，即去除样品后的溶剂，在这里为0.5ml四氯化碳＋25ml双缩脲试剂。）

6.2  凯氏定氮法测定发酵后的面粉蛋白含量

    6.2.1  面粉的发酵。  精确称量面粉1g,优质干酵母0.02g,蔗糖0.02g加适量水混匀封口后在向阳处发酵。时间一个小时。

    6.2.2  取发酵后的面粉（所有），移入干燥的100ml或500ml定氮瓶中，加入0.2g硫酸铜，6g硫酸钾及20毫升硫酸，稍摇匀后于瓶口放一小漏斗，将瓶以45度角斜支于有小孔的石棉网上，小火加热，待内容物全部炭化，泡沫完全停止后，加强火力，并保持瓶内液体微沸，至液体呈蓝绿色澄清透明后，再继续加热0.5小时。取下放冷，小心加20ml水，放冷后，移入100ml容量瓶中，并用少量水洗定氮瓶，洗液并入容量瓶中，再加水至刻度，混匀备用。取与处理样品相同量的硫酸铜、硫酸钾、浓硫酸同一方法做试剂空白试验。 　　

    6.2.3  装好定氮装置，于水蒸气发生器内装水约2/3处加甲基红指示剂数滴及数毫升硫酸，以保持水呈酸性，加入数粒玻璃珠以防暴沸，用调压器控制，加热煮沸水蒸气发生瓶内的水。 　

6.2.4  向接收瓶内加入10ml 2%硼酸溶液及混合指示剂1滴，并使冷凝管的下端插入液面下，吸取10.0ml样品消化液由小玻璃杯流入反应室，并以10ml水洗涤小烧杯使流入反应室内，塞紧小玻璃杯的棒状玻璃塞。将10ml 50%氢氧化钠溶液倒入小玻璃杯，提起玻璃塞使其缓慢流入反应室，立即将玻璃盖塞紧，并加水于小玻璃杯以防漏气。夹紧螺旋夹，开始蒸馏，蒸气通入反应室使氨通过冷凝管而进入接收瓶内，蒸馏5min。移动接收瓶，使冷凝管下端离开液皿，再蒸馏1min，然后用少量水冲洗冷凝管下端外部。取下接收瓶，以0.01N盐酸标准溶液定至灰色或蓝紫色为终点。同时吸取10.0ml试剂空白消化液按3操作。

7、结果及计算

7.1  未发酵面粉的测定及数据处理

    OD值所对应的蛋白质毫克数×25.5/6/200 ×100％ 即面粉中蛋白的百分含量。

OD值：

蛋白含量的计算： OD值所对应的蛋白质毫克数×25.5/6/200 ×100％

7.2  面粉发酵后的蛋白测定数据及其处理

公式：X =[（V1-V2）× N×0.014]/[ m ×（10/100）] ×F×100%　 　　

X：样品中蛋白质的百分含量，g； 　　V1：样品消耗硫酸或盐酸标准液的体积，ml； 　　V2：试剂空白消耗硫酸或盐酸标准溶液的体积，ml； 　　N：盐酸标准溶液的当量浓度； 　　0.014：1N硫酸或盐酸标准溶液1ml相当于氮克数； 　　m：样品的质量（体积），g（ml）； 　　F：氮换算为蛋白质的系数。蛋白质中的氮含量一般为15～17.6%，按16%计算乘以6.25即为蛋白质，乳制品为6.38，面粉为5.70，玉米、高粱为6.24，花生为5.46，米为5.95，大豆及其制品为5.71，肉与肉制品为6.25，大麦、小米、燕麦、裸麦为5.83，芝麻、向日葵为 5.30。

数据记录：

7.3  两个实验结果的对比及分析

8、注意事项

8.1  双缩脲法应注意的事项

标准曲线绘制和样品测定应使用同一台分光光度计。注意事项

    8.1.1  本法应用范围，因不同书籍报道，数值不一。本实验方法测定范围1—10mg蛋白质/ml。

    8.1.2  须于显色后30min内比色测定。30min后，可有雾状沉淀发生。各管由显色到比色的时间应尽可能一致。

    8.1.3  有大量脂肪性物质同时存在时，会产生混浊的反应混合物，这时可用乙醇或石油醚使溶液澄清后离心，取上清液再测定。

8.2  凯氏定氮法应注意的事项

    8.2.1  定氮仪各连接处应使玻璃对玻璃外套橡皮管绝对不能漏气。

    8.2.2  所用橡皮管，塞须经处理。方法是：浸在10%NaOH溶液中煮约10分钟，水洗，水煮10min,在水洗数次。

    8.2.3  蒸馏过程中切忌火力不稳，否则将发生倒吸现象。

    8.2.4  面粉的发酵必须保证有良好的外界条件

9、费用预算

药品价格来自互联网（淘宝网）

浓硫酸：18元580ml        硫酸铜：2.5元60g        硫酸钾：5元500g

双缩脲试剂：18元25g      NaOH:30元500ml(40%)     酪蛋白：388元1000g

硼酸：9元500g            四氯化碳：26元1000g     甲基红：11元25g

甲烯蓝：11元25g          乙醇：28元2500ml        去离子水：3.8元500ml

电费：5毛/度

根据价格及用量估算实验费用在18元左右。

参 考 文 献

《酵母生物化学》  山东科学技术出版社

《生物化学实验》  科学出版社

中国科技网下载本文