| 动物细胞培养反应器 |
动物细胞培养反应器-分类及结构特点
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搅拌式反应器靠搅拌桨提供液相搅拌的动力，它有较大的操作范围、良好的混合性和浓度均匀性，因此在生物反应中被广泛使用。但由于动物细胞没有细胞壁的保护，因此对剪切作用十分敏感，直接的机械搅拌很容易对其造成损害，传统的用于微生物的搅拌反应器用作动物细胞的培养显然是不合适的。所以，动物细胞培养中的搅拌式反应器都是经过改进的，包括改进供氧方式、搅拌桨的形式及在反应器内加装辅件等。
（1）供氧方式的改进
一般情况下搅拌式反应器还常伴有鼓泡，为细胞生长提供所需氧分。由于动物细胞对鼓泡的剪胞生长提供所需氧分。由于动物细胞对鼓泡的剪切也很敏感，所以人们在供氧方式的改进上做了许多工作。
笼式供氧是搅拌式动物细胞反应器供氧方式的一种，即气泡用丝网隔开，不与细胞直接接触。反应器既能保证混合效果又有尽可能小的剪切力，以满足细胞生长的要求。北野昭一报道了一个经过改进的搅拌式动物细胞反应器，整体呈梨形，搅拌置于反应器底部，在搅拌轴外装了一个锥形不锈钢丝网与搅拌轴一起转动。轴心处的鼓泡管在丝网内侧鼓泡，丝网外侧的细胞不与气泡直接接触。
（2）搅拌桨的改进
搅拌桨的形式对细胞生长的影响非常大，这方面的改进主要考虑如何减小细胞所受的剪切力。有人对搅拌桨的形式作了改进，并在反应器内加装了辅件，实验证明改进后的反应器适用于对剪切力敏感的细胞进行高密度培养。反应器采用了一个双螺旋带状搅拌桨，顶部的法兰盖上安装了3块表面挡板。每块挡板相对于径向的夹角为30°，垂直插入液面。挡板的存在减小了液面上的旋涡。这个反应器维持了较小的剪切力，实验中用于昆虫细胞的培养，最终的培养密度达到6×106个/mL，成活率在98%以上。
2、非搅拌式生物反应器
|搅拌式生物反应器用于动物细胞培养存在的最大缺点是剪切力大，容易损伤细胞，虽然经过各种改进，这个问题仍很难避免。相比之下，非搅拌式反应器产生的剪切力较小，在动物细胞培养中表现出了较强的优势。
（1）填充床反应器
填充是在反应器中填充一定材质的填充物，供细胞贴壁生长。营养液通过循环灌流的方式提供，并可在循环过程中不断补充。细胞生长所需的氧分也可以在反应器外通过循环的营养液携带，因而不会有气泡伤及细胞。这类反应器剪切力小，适合细胞高密度生长。
（2）中空纤维反应器
中空纤维反应器由于剪切力小而广泛用于动物细胞的培养。这类反应器由中空纤维管组成，每根中空纤维管的内径约为200μm，壁厚为50～70μm。管壁是多孔膜，O2和CO2等小分子可以自由透过膜扩散，动物细胞贴附在中空纤维管外壁生长，可以很方便地获取氧分。
（3）气升式生物反应器
气升式生物反应器(airliftbioreactor)也是实现动物细胞高密度培养的常用设备之一，其特点是结构简单，操作方便；湍动温和而均匀，剪切力小；无机械运动部件，细胞损伤极低；反应器内液体循环量大，细胞和营养成分能均匀分布于培养器中。有人在气升式反应器中利用微载体培养技术，研究了Vero细胞高密度培养的工艺条件。证明气升式反应器中悬浮微载体培养Vero细胞，在加入适量保护剂、营养供应充足的情况下，细胞可以正常生长至长满微载体表面，终密度可达1.13×106个/mL。
动物细胞培养反应器-产品特点
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生物反应器产业本身很难有每年达数十亿元的产值，但其在生物技术产业链中却起着再生产和扩大再生产的作用，达上百亿元以上。有时一个新的生物反应器技术的应用和推广，就可能促进某一生物技术产品的产业化形成，提高生产能力，或降低生产成本，可节约能耗达数十亿元之巨。
(2)、产品多样性
目前用于生产的细胞和生物材料有微生物、动植物细胞、藻类、各种酶类等。不同细胞或酶有不同特点，因而有不同生物反应器设计要求。
生物反应器种类有气升式反应器和机械搅拌反应器；常规反应器和光生物反应器；好氧和厌氧反应器；液体深层培养反应器和固体发酵反应器；根据不同机械结构划分的反应器；不同控制原理划分的反应器等。此外，生物反应的规模也可由几十毫升到上百M3不等。
由此可见，很难规定几个通用产品进行大批量生产，大多数用户根据自己的研究或生产特点，提出不同的定货要求，反应器研制厂家必需有足够的技术力量和经验进行非定型化设计，以满足用户要求。
(3)、生物过程优化与放大技术
具有先进的生物过程优化和放大能力是生物反应器设计的核心技术。由于在生物反应器中所发生的反应是在分子水平的遗传特性、细胞水平的代谢调节和反应器工程水平的混和传递等多尺度（水平）上发生的。因此，如何利用生物反应器中的多参数检测技术和在线计算机控制与数据处理技术，把细胞在反应器中各种表型数据与代谢有关的基因结构研究关联起来，是反应器过程优化与放大的重要内容，也是当前国内外竞相发展的具有原创性的知识产权技术，对促进生物技术产业化发展具有重要意义。由此可见，提供包含以上功能并具有自主知识产权的商品化生物反应器应是我国生物反应器产业的重点之一。
(4)、生物技术发展要求性能更高的生物反应器
为了适应各种生物技术的实验室成果向产业化转化的需要，对生物反应器的性能要求愈来愈高，目前主要表现为：
用于基因工程高密度高表达，符合GMP标准的生物反应器以及一些新技术的应用等。其中关于供氧问题，快速升温、SIP自动灭菌、CIP自动清洗、机械密封、排气处理、取样处理等问题以及培养液成份的流动注射分析（FIA）分析等都需很好解决。
哺乳类动物细胞大规模培养是当前生产高附加值的糖基化活性蛋白医药产品的重要发展趋势。根据动物细胞无细胞壁，对剪切极端敏感，在细胞生长控制上，要防止细胞分化和细胞凋亡，有时还要考虑对产品糖基化质量的要求。所以反应器要具备低剪切效应，混合性能好等特点，要提供细胞形态在线观察和活细胞数量的传感技术，严格控制反应器的操作条件以及有关防污染的灌注系统、取样系统等都需要研究解决。
用于细胞过程生理特性和过程传递特性研究的生物反应器研制，其中主要解决用于过程分析的各种传感器选型研制和数据处理软件包的研制。特别是近年来随着微生物基因组测序和系统生物学研究工作的深入展开，发酵过程检测与控测已经从基于参数传感技术的反馈控制发展为以信息处理为基础的生物过程检测与分析。各种谱分析与生物反应器实验数据关联起来，提供各种表型数据具有重要意义。因而对反应器设计提出了新的要求。
随着生物技术在各领域的推广应用，用于海洋藻类、微生物肥料、微生态饲料、环境污染处理等大规模细胞培养需要高强度低造价的生物反应器。特别是近年来利用生物质生产燃料乙醇等能源物质的战略部署，需要应用大型高效节能生物反应器降低生产成本。
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生物反应器是多专业技术发展的综合体，由于反应器零部件技术的进步，必须及时更新产品设计，为用户提供性能更好且价格合理的反应器产品。这些零部件技术包括计算机软硬件技术、各种传感技术、反应器流型设计，新机械结构和材料等等。此外，随着信息处理技术的发展，如何实现大批量数据处理、贮存与通信，把生物信息学与过程信息结合起来实现复杂生物系统的分析与控制，也以软件包的形式逐渐从实验室研究走向商品化。
(6)、产品生产的标准化、规范化
作为商品化装置的市场化，建立生物反应器生产标准，实施IS09001管理是发展生物反应器产业的重要内容，只有这样才能提供合符用户要求及质量稳定的产品。主要内容有：
产品装置成套加工的工艺技术路线的确定与质量控制研究。在生物反应器制造过程中，如材料、焊接、表面处理、零部件机加工、外购件、易耗品…、直到安装流程工艺、器材仓库管理…等都要严格实施质量检验；
原材料、半成品、成品标准等的确立与实施。如有关传感器及一些如空气过滤器、阀件、质量流量计等关键部件的测试标准的建立与研究，整机性能测试标准的建立与研究；
产品质量过程控制程序的确立与实施等；整机性能测试标准的建立与研究。
(7)、高品质的售后技术支持
由于生物反应器中的反应是在基因、细胞和反应器工程水平上多尺度发生的，因而真正利用生物反应器实现过程优化是有难度的，从理论到实践的提高，并进一步在生物技术产品生产中发挥作用，需要有一个过程，应该把售前宣传和售后服务等与整体应用技术提高结合起来才能取得好的效果。
动物细胞培养反应器-技术研发
| 动物细胞结构图 |
1、动物细胞无血清悬浮培养技术
研制开发了多种适合于杂交瘤细胞、rCHO细胞、昆虫细胞大规模悬浮培养过程的无血清/无蛋白培养基组成，成分明确，且细胞生长和产物表达水平与有血清培养基相当，成本比国外同类产品降低30%以上，其技术特点在于不仅能促进细胞生长、防止细胞损伤，而且还能支持细胞在大规模生物反应器中实现高密度培养，并有利于泡沫控制。
2、动物细胞培养过程及生物反应器设计放大与强化技术
与几何放大、因次放大等经验放大方法不同的是，本平台所拥有的动物细胞培养过程及生物反应器放大与强化技术是根据动物细胞大规模高密度培养过程的特点，在气液传质和流体力学等理论的指导下，在认识细胞与流体剪切力、细胞与气泡相互作用机理的基础上，其核心是采用机械搅拌和直接通气鼓泡强化气液传质能力和流体混合条件，以使培养过程和生物反应器能支持108cell/ml以上细胞密度生长的能力，同时能有效消除流体剪切和气泡对细胞的损伤与破损作用，实现放大过程中强化供氧混合与防止细胞破损的统一，使大规模细胞培养过程及其生物反应器能够重复实验规模的试验结果，从而为动物细胞表达产品的工业化生产提供宽广的放大与强化空间。同时，本平台也已具备100升以上规模高密度动物细胞培养过程及其各类生物反应器系统的研究设计和开发能力。
3、动物细胞大规模高密度流加和连续灌注培养技术
与已往连续流加和灌注培养技术不同的是，本平台所建立的动物细胞高密度连续流加和灌注培养技术的特点是通过细胞的生理状态和代谢网络，设计优化的培养基营养组成和流加、灌注技术，从而提高营养物代谢和能量利用率，降低有毒副产物生成，有效解决营养物耗竭和有毒副产物积累的矛盾，这样可在相同培养基流加或灌注速率的条件下细胞密度可比现有流加或灌注培养技术提高四至五倍，上清夜中目标产物浓度可比传统批式（Batch）培养提高六至十倍以上，生产过程产率和生物反应器生产能力则可同时提高数十倍，从而显著提高细胞培养过程的经济性，彻底改变传统灌注培养方式只提高产量不提高经济性的缺陷。
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在病毒类产品工业化生产过程开发方面，现已建立起集生物反应器、微载体和动物细胞（Vero、BHK等）大规模培养技术为一体的人畜用病毒疫苗工业化生产技术，和以293细胞无血清悬浮培养技术为核心的病毒载体高效生产技术，不仅为病毒类产品的工业化生产解决了规模问题，彻底改变了传统手工式和经验式的滚瓶生产方式，而且通过研究和优化细胞生理状态与病毒感染复制的关系，显著提升工业化生产过程的经济性。在50L生物反应器中批式培养上述细胞，其密度可达3×106cells/mL以上，灌注培养细胞密度可达1×107cells/mL以上，病毒滴度比传统滚瓶工艺提高2至3个单位（相当于浓度单位2至3个数量级）。目前已能结合具体病毒类产品进行工业化生产过程的开发和优化。
5、培养过程计算机实时监测与控制技术
传统动物细胞培养过程及其生物反应器能够进行实时监测和控制的参数只有温度、搅拌转速、溶解氧浓度（DO）和pH值等物理环境参数，而与细胞生理状态和代谢活性相关的生理生化参数却一概不能进行实时检测和控制，与此不同的是本平台所建立的计算机实时监测与控制技术，是利用OUR（细胞耗氧速率）与细胞生长动力学、代谢动力学参数间的关系，通过计算机在线检测培养过程中OUR的变化，以监测和控制培养过程中的细胞密度、细胞代谢活性、细胞生长速率、营养物代谢途径和目标产物表达等生理生化关键参数，从而为动物细胞工业化培养过程的自动在线监测和控制奠定了基础。
动物细胞培养反应器-现状
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近年来，国内有关生物反应器产业发展较快，有关产品生产的公司企业已达十多家，在这些公司的努力下，一改过去基本由国外产品统治国内市场的局面，特别在低端产品上已基本由国内控制。但是这些公司大都主要从事中低档产品生产，企业技术力量以仿制为主，着重于以降低生产成本为目标的零部件替换研究，虽然产品的标准有所下降，但也能满足一般用户的需要，特别对生物技术产业刚起步的或优化放大要求不高的企业或教学单位，低价的产品己可以适应他们的要求。但是对一些性能要求高的商品化生物反应器，如SIP自动灭菌与CIP清洗的全自动生物反应器、生物反应器的自动取样与分析系统等，一些重要器件如耐高温灭菌的隔膜阀的抗疲劳、抗澎胀性以及器件加工工艺与标准都有差距，特别是一些符合GMP要求的高端生物技术产品所需的装备或成套设备主要还是由国外公司提供。由于这些国内公司缺乏生物过程技术的研究力量以及工艺、工程、装备一体化的研究体系，因而不能随着生物技术发展有同步生物反应器的开发能力，例如对于大规模动物细胞生物反应器，至今国内还没有符合要求的定型产品推出。此外，对与生物技术深度结合的高度自动化的实验室装置缺乏试制能力，因而只能是简单的外型仿制和跟踪，缺乏创新的自主知识产权产品。
由此可见，面临着生物技术的深入发展，如何解决提高生产能力为目标的行业技术改造，以及加入WTO后和国外高档产品的市场竞争，我们必须大力开发具有自主知识产权的性能优越的反应器技术并商品化，以适应推动生物技术产业化的进一步发展需要。
动物细胞培养反应器-发展趋势
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长期来发酵过程优化与放大所依据的基本思想和方法是采用经典动力学为基础的最佳工艺控制点为依据的静态操作方法，实质上这只是化学工程宏观动力学概念在发酵工程上的延伸。例如，用氨水调节pH时，关心的是最佳pH值，却不注意氨水加量的动态变化及其与其他参数的关系。在溶解氧浓度（DO）测量与控制时，关心的是最佳DO值或临界值，不注意细胞代谢时的耗氧率。显而易见，用在以活细胞代谢为主体的发酵过程就有很大的局限性，应该重视细胞代谢流的存在。
随着过程传感技术和计算机技术的发展，国家生化工程技术研究中心（上海）设计了一种用于生物过程多尺度研究的新概念发酵装置（已由上海国强生化工程装备有限公司组织生产，定型为FUS-50L（A）），该装置以生物反应器中物料流检测的观点，具有十四个以上在线参数检测或控制，并集中力量开发了一个适应多种反应器特点，融合多种过程理论和控制理论，便于发酵过程工艺分析和优化操作的软件包。在鸟苷发酵过程中，从反应器测量参数上发现了细胞代谢流迁移，由此实现了过程优化[]。该产品先后成功地在青霉素、红霉素、饲料金霉素、链霉素、黄霉素、泰乐霉素、棒酸、鸟苷、肌苷、基因工程白蛋白、基因工程疟疾疫苗、基因工程植酸酶、胰岛素原（PIP）、基因工程必特螺旋霉素等多种产品上发酵优化应用取得了大幅提高发酵单位能力，其优化结果一般可由几十升发酵罐直接放大到上百立方的工业生产发酵罐。
2、动物细胞大规模培养生物反应器研制
由于细菌等原核细胞表达系统在转录及修饰方面的缺陷，许多重要价值的蛋白质，特别是基因工程药物、疫苗、抗体等糖基化的需要，使哺乳类动物细胞表达系统成了一个更合适的工具，因此，哺乳类动物细胞表达系统引起了大家重视。以哺乳动物大规模培养技术为基础的生物制药产业在美国等西方国家得到了迅速发展，数十种产品已进入市场，取得了巨大的经济和社会效益。
国外用于生产的动物细胞生物反应器已趋于大型化（最大到吨级规模）、多参数与高度自动化的计算机控制系统、以及适应动物细胞对大型环境因子高敏感性的反应器精巧设计制造，并形成商品化供应用户。中国自“七五”至“八五”攻关期间立题开展有关动物细胞生物反应器研究，取得了较大进展，但哺乳类细胞培养技术要求高，技术壁垒大，有关公司在未能掌握核心技术的情况下，单凭模拟很难开展工作。抗体等其他细胞表达产品，装药量大，中国科研单位已经掌握的早期生物药开发技术很难应用到新型药物生产工艺上，需要重新摸索；由于细胞株等上游配套技术的落后、反应器研制技术的差距、以及有关缺乏生化工程的研究等原因，因而缺乏必要的条件去掌握高表达细胞株构建和大规模细胞培养技术，难以突破技术瓶颈，中国有关动物细胞生物反应器产业仍近乎空白。
3、带pH测量与补料控制的摇床──摇床应用技术的发展
20世纪三十年代摇床问世以来，摇床就作为生物反应过程中必备的一种专用设备，用于微生物、动植物细胞菌种筛选、种子扩大培养等。由于摇床设备的特点，不能实时测量培养过程中的有关参数以及过程补料控制，因此长期以来一直以摇床的放瓶结果作为实验数据。当用来作为诸如菌种生理特性变化、培养基成分的作用以及温度、pH等环境条件变化等研究的依据时,实际上是一种缺乏过程研究的静态分析方法。这种方法的局限性是很显然的，例如以这种方法作为菌种选育后技术时，传统摇瓶筛选方法往往缺乏补料或供氧不足，并不一定处于代谢流分配最合理的状态，由此将出现严重的高产菌株漏筛现象。因此，国内外有关公司己注意开发带pH测量的摇床，并形成产品。
4、生物反应器中试系统设计
对于生产量大的传统生物技术产品，为了对已经通过前期研究（实验室研究和市场分析）的产品进行过程优化研究，在中试规模上达到高生产水平或质量，并进而为车间生产提供工艺放大依据和设备设计依据，必要时还可进行小批量生产，提供应用试验样品、或供市场销售的部分产品。为此，近年来许多有关发酵产品生产的企业迫切需要建立一个多功能的中试发酵车间。
5、大型生物反应器设计与制造技术研究
几十年来随着发酵工业的快速发展，发酵工程趋向设备大型化、高效和自动化。以传统生物技术产品来说，一些氨基酸、抗生素或发酵轻化工产品都在几十到几百M3以上发展，一些原来是小规模发酵罐的老厂搬迁新厂区，发酵罐的规模也普遍要求放大。基因工程产品一般附加值高，不需要大型生物反应器，但近年来随着基因工程酶生产技术的发展，如基因工程植酸酶的研究成功，又由于饲料添加剂的需求量大，用于基因工程高密度高表达的大型生物反应器研制已势在必行。特别是今后随着矿物质能源的耗竭，利用生物质生产燃料乙醇等已提到重要战略议事日程，高效节能的大型发酵装置的应用是降低生产成本的不可缺少的关键技术，如美国、巴西等国家已达2000M3以上发酵装置。
