周娟1, 张梦军2, 张惠静1,2, 郭嘉伟2, 李滨3
(1重庆大学化学化工学院,重庆,400044; 2第三军医大学药学院药物分析与分析化学教研室，
重庆,400038;3重庆市科学技术研究院,重庆, 401123)
摘要：小鼠耳肿胀模型因价格便宜、操作简便、易于测量和模型稳定等特点，广泛用于合成化合物和植物有效成分的抗炎活性评价。本文介绍了二甲苯、佛波酯、花生四烯酸、组胺、辣椒素和地蒽酚诱导的小鼠耳肿胀模型的造模方法、作用机理和应用特点，希望能为初步评价抗炎药物的药效和机制研究提供新的思路。
关键词：耳肿胀模型; 炎症;佛波酯; 花生四烯酸
第一作者简介：周娟，女，硕士研究生 研究方向：抗炎药物的药效及机制研究
炎症是损伤和抗损伤的统一过程。尽管炎症反应过程中，通过实质和间质细胞的再生使受损的组织得以修复和愈合，但损伤因子直接或间接造成组织和细胞的破坏，也会给机体带来损伤，如引起疖、痈、肺炎、关节炎以及机体失调，而抗炎药能治疗组织受到的这种损伤。目前的抗炎药物仍存在许多问题，如选择性较差、会引起胃肠道不适、肾功能衰竭和心功能衰竭等副作用。因此寻找安全有效的抗炎药物，以及选择合适的动物模型来初步评价抗炎药的药效和机制仍是众多学者共同关注的问题。
炎症根据感染的途径分为感染性炎症和非感染性炎症。感染性炎症主要是由生物病原体引起。非感染性炎症包括无菌性炎症（非特异性炎症）和变态反应性炎症。小鼠耳肿胀模型是非特异性炎症模型的一种，主要是以化学物质作为致炎剂来诱导小鼠耳肿胀。近几年来，小鼠耳肿胀模型已发展成为一类比较成熟的动物炎症模型，由于其操作简单、模型稳定且小鼠价格便宜等优点，常用它来评价一些合成化合物和植物有效成分的抗炎活性[1-3]。
小鼠耳肿胀模型常用的致炎物质有二甲苯、花生四烯酸（Arachidonic Acid, AA）、佛波酯（12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate, TPA/PMA）、巴豆油、组胺、辣椒素和地蒽酚等。然而，不同的致炎物质诱导的小鼠耳肿胀模型的机理存在较大的差异，下面我们将阐述不同致炎物质诱导的小鼠耳肿胀模型的造模方法、机理和应用特点。
一、二甲苯诱导的小鼠耳肿胀模型
二甲苯诱导的小鼠耳肿胀模型的造模方法：将20ul二甲苯均匀地涂抹在小鼠左耳或右耳内、外两侧，30至60min之内达到最大肿胀度，90min后肿胀基本消除。实验中通常选择在给二甲苯1h左右断颈处死小鼠[4, 5]，用打孔器取双侧耳部同一部位的耳片,称重后计算两耳片的重量差作为检测指标；也可通过测厚仪测量小鼠耳肿胀前后的耳厚度，从而计算出药物对炎症的抑制率。二甲苯模型主要机理是致使某些炎症介质如组胺、激肽和纤维蛋白溶解释放，引起局部血管扩张，毛细管通透性增加，炎症细胞浸润，造成耳部急性渗出性炎症水肿。一般皮质类固醇如地塞米松，能有效的抑制这种皮炎，常作为此模型的阳性药物。近年来，二甲苯诱导的小鼠耳肿胀模型在国内应用广泛[4, 5]，但国外则很少采用。我们在实验过程中发现该模型与其它耳肿胀模型相比，小鼠耳肿胀率个体差异比较大，模型不够稳定，这可能是在国外应用不广泛的原因之一。此模型成本低、制作简单，一般用于初步评价药物的抗炎作用，但由于肿胀持续时间较短，所以用它来评价药物的抗炎作用也存在许多不足之处。尤其是对于那些抗炎作用发挥缓慢的化合物来说，不适合采用此模型。
二、佛波酯诱导的小鼠耳肿胀模型
佛波酯（TPA）诱导的耳肿胀模型分为单次刺激和多次刺激两种。TPA单次刺激诱导的小鼠耳肿胀模型是一个亚急性模型，其造模方法和二甲苯诱导的耳肿胀模型类似，一般把TPA溶于丙酮中，每只小鼠使用的TPA剂量多为2.0ug/ear[3]或2.5ug/ear[6]。我们在用TPA 诱导耳肿胀模型时，发现TPA涂抹后3h之内，小鼠耳朵厚度几乎没有变化，随后耳朵逐渐增厚变红，6h左右达到最大肿胀度。我们实验结果的肿胀度随时间变化曲线如图1所示，与文献结果一致[7]。大多数研究者选择涂抹TPA 6h后处死小鼠[6]（也有选择4h后处死小鼠的[8]），通过打孔器取双侧耳部同一部位的耳片，称重计算两耳片的重量差或者用测厚仪测量小鼠耳肿胀前后的耳厚度，计算出药物对炎症的抑制率。TPA诱导的耳肿胀模型的主要机理[9, 10]：①能诱导TNF-α，IL-1β和IL-6等炎症因子；②通过活化环氧合酶（cycloxygenase，COX）和5-脂氧化酶（5-lipoxygenase, 5-LOX），增加花生四烯酸代谢物前列腺素D2（PEG2）和白三烯（LTB4）的浓度；③促进组胺和5-羟色胺的释放。抗组胺药、皮质类固醇如地塞米松和环氧合酶抑制剂如吲哚美辛，都有效抑制单次TPA诱导的炎症。
TPA多次刺激诱导的小鼠耳肿胀模型具体操作方法如图2所示[10]，最后一天给药6h后处死小鼠，用TPA单次刺激实验相同的方法采集实验数据。TPA多次刺激诱导的小鼠耳肿胀模型是一个慢性模型，此模型会使小鼠耳朵出现表皮增生和严重的皮肤炎症[11]。Paul L.Stanley 等人的实验证明TPA多次刺激模型，用抗组胺药没有抑制作用，说明此炎症模型不涉及或者组胺不是最主要的致肿胀的原因；并且从他们的实验结果可知环氧合酶抑制剂吲哚美辛、布洛芬和萘普生都对此模型也没有抑制作用[10]。另外，有些文献还报道萘普生会增强此模型小鼠耳朵细胞浸润；口服或者局部涂抹环氧合酶抑制剂吲哚美辛，小鼠表现出银屑病加重的情况[12]。然而，局部涂抹甾体抗炎药物通过抑制磷脂酶A2的活性，可有效的治疗TPA多次刺激诱导的小鼠耳肿胀、髓过氧化物酶增多和表皮增生的症状。同时，在此炎症模型实验中检测到了白细胞三烯B4，它是花生四烯酸在脂氧化酶作用下的主要代谢产物，因此5-LOX抑制剂能够有效的抑制该炎症模型[13]。
国内常常用巴豆油诱导小鼠耳肿胀，实际上巴豆油的主要成分即是TPA，而TPA诱导的小鼠耳肿胀模型在国外应用更为广泛。其中TPA单次刺激诱导的小鼠耳肿胀模型，因其具有广泛的作用机制，且模型相当稳定，持续时间较久，对于筛选抗炎药物和评价其抗炎疗效非常重要。TPA多次刺激诱导的小鼠耳肿胀虽然造模时间较长，但由于它主要是通过5-LOX途径和磷脂酶A2来诱导炎症，所以选择性较强，常用此模型评价5-LOX抑制剂和甾体类抗炎药物。
图1 TPA单次刺激诱导的小鼠耳厚度随时间的变化曲线
图2 TPA多次刺激诱导小鼠耳肿胀的实验方法
三、花生四烯酸诱导的小鼠耳肿胀模型
花生四烯酸(AA)诱导的小鼠耳肿胀模型其造模方法和二甲苯诱导的耳肿胀模型类似，一般把AA溶于丙酮中，每只小鼠使用的AA剂量多为2.0ug/ear[14]。在小鼠的耳两侧涂抹AA 5min后，会诱导产生血管舒张和红斑，40-60min后发展为炎症且达到最大肿胀度，60min 后水肿开始消退并且炎症细胞也逐渐离开此炎症组织，6h后小鼠耳朵基本恢复到正常状态。不同剂量的AA诱导的小鼠耳朵肿胀度随时间变化的曲线如图3所示，我们的实验结果与John M等的实验结果一致[15]。在评价某化合物的抗炎作用时，通常选择致炎1h左右为数据采集时间点。小鼠耳朵在整个过程的病理特征表现为血管扩张、充血、疼痛、水肿和炎症细胞的浸润。花生四烯酸诱导的小鼠耳肿胀机理主要由白三烯（LTC4、LTD4）和其他脂肪氧化酶介导，而在白三烯存在的情况下前列腺素会促进小鼠耳肿胀。众所周知，AA的代谢主要是通过环氧合酶（COX）和5-脂氧化酶（5-LOX）两种途径作用形成前列腺素D2（PEG2）和白三烯（LTB4），但是在用AA作为小鼠耳肿胀模型的致炎剂时，AA的代谢途径和其使用的剂量密切相关。当以较低剂量(0.5mg/ear)刺激时，AA以环氧合酶为主要代谢途径，COX 抑制剂与COX和LOX双重抑制剂能有效抑制AA诱导的耳肿胀，皮质类固醇仅能稍微抑制；而当AA的剂量大于2mg/ear时，则主要通过5-脂氧化酶途径代谢，5-脂氧化酶抑制剂能有效抑制该炎症，环氧合酶抑制剂不但不能抑制反而还可能使小鼠耳肿胀加重[15]。由于AA致炎过程还伴随着一系列复杂的炎症介质，如血清素、组胺和激肽的释放，所以抗组胺药也能减轻AA诱导的水肿[9, 16]。与其他耳肿胀模型相比，在高剂量时它对5-LOX抑制剂的选择性更强、更明确。此外，AA诱导的耳肿胀模型也很稳定，在国外的抗炎药物的筛选中常采用该模型[17]。
图3 AA诱导的小鼠耳厚度随时间的变化曲线
四、组胺诱导的小鼠耳肿胀模型
组胺诱导的小鼠耳肿胀模型其操作方法比较特殊，一般于小鼠耳朵背面采用皮内注射组胺的方法来诱导炎症。每只小鼠注射剂量一般为0.5mg[18]。组胺诱导的小鼠耳肿胀模型是一个急性模型，一般在15min左右达到最大肿胀度，然后逐渐消退[19]。组胺诱发皮肤炎症的特点：从最初的皮肤发红，血浆外渗，组织水肿发展到红斑广泛蔓延[20]。此模型中，风团及潮红是组胺诱导的皮肤炎症的主要症状，这种症状的发展往往伴随着瘙痒，所以在实验过程中我们会看到小鼠抓挠的现象。人们可以通过模型组和药物组小鼠的抓挠次数或者抓挠后皮肤的损伤程度来评价化合物的药效。研究表明，不管是动物模型还是人，组胺都是一种重要的皮肤血管反应调节介质，并且证明H1受体拮抗剂可以不同程度的抑制风团，潮红和瘙痒症状[21]。
五、辣椒素诱导的小鼠耳肿胀模型
辣椒素是典型的神经性刺激剂，其诱导的小鼠耳肿胀在1h左右达到最大肿胀度，而后肿胀不断消除，24h后接近正常耳朵[22]。在目前的实验中，此模型一般注射40ug/ear的量来诱导小鼠耳肿胀。辣椒素诱导的小鼠耳水肿的形成主要由神经肽介导，如降钙素基因相关肽，P物质，神经激肽A和血管活性肠肽，这些都是辣椒素敏感的神经元释放。H1组胺拮抗剂和血清素拮抗剂，脂氧合酶/环氧合酶双重抑制剂如二氢愈创酸和P物质拮抗剂对辣椒素引起的小鼠耳肿胀有良好的抑制作用[9]。
六、地蒽酚诱导的小鼠耳肿胀模型
地蒽酚诱导的小鼠耳朵炎症机理近年来得以阐明。一般认为血小板活化因子（PAF），前列腺素，组胺和活性氧自由基参与了地蒽酚引起的耳水肿，所以血小板活化因子受体拮抗剂银杏内酯B，环氧合酶抑制剂吲哚美辛，抗组胺药氯马斯汀以及抗氧化超氧化物歧化酶（SOD）对地蒽酚诱导的耳肿胀有抑制作用。另外，皮质类固醇、自由基清除剂和血清素拮抗剂对该模型也有效[9]。此模型相对其他耳肿胀模型来说只在国外应用较多，而国内则很少有人采用。
总之，小鼠耳肿胀模型由于选择的致炎物质不同，其产生的病理机制和病理过程也不完全相同，操作程序和持续时间也会有所差别。因此，我们先要清楚所用致炎剂诱导的小鼠耳肿胀模型的主要机理，根据自己实验的目的来选择合适的致炎剂，才能从实验结果中推断受试化合物的可能作用机理。如在实验过程中，通常会出现化合物或者植物有效成分对某种致炎剂诱导的炎症有作用，而对另外一种致炎剂诱导的没有作用，因此我们就能很好的判断受试化合物抑制炎症的可能机理和途径。由于小鼠耳肿胀模型价格便宜、操作简便、易于测量和稳定等特点，近年来多被选用。我们总结了几种国内外常用且成熟的小鼠耳肿胀模型的造模方法、主要机理和特点，希望能为初步评价抗炎药物的药效和机制研究提供新的思路。
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