1、反义RNA：指与mRNA互补的RNA分子，也包括与其它RNA互补的RNA分子。根据反义RNA的作用机制可将其分为3类：Ⅰ类反义RNA直接作用于靶mRNA的S D序列和(或)部分编码区，直接抑制翻译，或与靶mRNA结合形成双链RNA，从而易被RNA酶Ⅲ 降解；Ⅱ类反义RNA与mRNA的非编码区结合，引起mRNA构象变化，抑制翻译；Ⅲ类反义RNA则直接抑制靶mRNA的转录。

2、生物芯片：生物芯片，又称DNA芯片或基因芯片，它们是DNA杂交探针技术与半导体工业技术相结合的结晶。该技术系指将大量探针分子固定于支持物上后与带荧光标记的DNA样品分子进行杂交，通过检测每个探针分子的杂交信号强度进而获取样品分子的数量和序列信息。

3、SD序列：mRNA起始密码子AUG上游8～13个碱基处存在的一段特定的核苷酸序列，该序列称为SD序列，是mRNA的起始密码子之所以能与小亚基定位结合的关键。SD序列与小亚基中16SrRNA3’端的序列互补，当mRNA与小亚基结合时，SD序列与16SrRNA3’端的互补序列配对结合，使起始密码子定位于翻译起始部位。

4、增强子：其含有多个作用原件，可以特异性地与转录因子结合，增强基因的转录活性的段短DNA序列。

5、基因表达：是指生物基因组中结构基因所携带的遗传信息经过转录、翻译等一系列过程，合成特定的蛋白质，进而发挥其特定的生物学功能和生物学效应的全过程。

6、核酸探针：指能识别特异碱基顺序的带有标记的一段单链DNA或RNA分子。

7、反式作用因子：真核细胞内含有的大量可以通过直接或间接结合顺式作用元件而调节基因转录活性的蛋白质因子。在结构上含有与DNA结合的结构域。

8、粘粒：又称柯斯质粒，是一类由人工构建的含有λDNA 粘性末端cos序列和质粒复制子的杂种质粒载体。它是为克隆和增殖真核基因组DNA的大区段而设计的，是组建真核生物基因文库及从多种生物中分离基因的有效手段。

10、转基因动物：应用转基因技术培育的携带外源基因并能稳定遗传的动物。

11、蛋白激酶：能够将γ-磷酸基团从磷酸供体分子上转移至底物蛋白的氨基酸受体上的一大类酶。

12、基因敲除：指通过DNA同源重组定向地将外源基因替换宿主细胞染色体DNA中特定的基因，从而使特定的基因在细胞内或生物体内失活的过程。

14、克隆：通过无性繁殖过程所产生的与亲代完全相同的子代群体。

15、基因组：细胞或生物体中，一套完整单倍体的遗传物质的总和。

17、质粒：是存在于细菌 染色体外的、具有自主复制能力的环状双链DNA分子。

18、RNA干涉：是指由短双链RNA诱导的同源mRNA的降解过程，可使基因表达受到抑制。

19、蛋白质组学：在整体水平上研究细胞内蛋白质组成及其活动规律的科学。

20、生物信息学：是研究生物信息的采集，处理，存储，传播，分析和解释等各方面的一门学科，它通过综合利用生物学，计算机科学和信息技术而揭示大量而复杂的生物数据所赋有的生物学奥秘。

21、顺式元件：是指那些与结构基因表达相关、能够被基因蛋白特异性识别和结合的特异DNA序列。包括启动子、上游启动子元件、增强子、反应元件和poly(A)加尾信号。

22、端粒：以线性染色体形式存在的真核基因组DNA末端都有一种特殊的结构叫端粒。该结构是一段DNA序列和蛋白质形成的一种复合体，仅在真核细胞染色体末端存在。端粒DNA由重复序列组成，人类端粒一端是TTAGGG另一端是AATCCC.

23、RFLP：个体之间DNA的核苷酸序列存在差异，称为DNA多态性。由于碱基组成的变化而改变了性内切酶的酶切位点，从而导致相应的性片段的长度和数量发生变化，称为RFLP。

25、启动子：能被RNA聚合酶识别并与其结合，启动转录的DNA序列。

27、性核酸内切酶：性核酸内切酶是细菌产生的一类能识别和切割双DNA分子内特定碱基顺序的核酸水解酶。

29、原癌基因（proto-oncogene)是细胞中的必需基因，进化过程中序列高度保

守，对维持细胞正常生理功能、调节细胞生长与增殖起重要作用。但如受到

致癌因素作用下可发生变化，表达产物的质或量改变或表达的时空方式改

变，而导致细胞恶性转化。

30、基因诊断：利用分子生物学技术方法，直接检测体内DNA或RNA的结构或水平的变化以及是否存在异常的外源核酸，从而对疾病作出诊断的方法。

31、基因治疗的概念：基因治疗是指通过一定方式将目的基因或有治疗作用的DNA片段导入人体的靶细胞，使其发挥生物学效应，从而达到治疗疾病目的技术疗方法。

33、PCR技术：可用于已知序列或部分已知序列的检测；或扩增出已知片段，再利用其他方法作进一步分析。灵敏度高、产率高、重复性好、快速简便，已成为基因诊断的主要和首选技术。但易出现假阳性，应注意优化实验条件。

问答：

1、简述基因治疗的基本程序。

1目的基因的选择和制备

2基因的转运

3选择治疗用靶细胞

4治疗性基因的导入

5外源基因的筛检

6导入体内

2、简述Rb基因产物的抑癌机制。

(1)Rb蛋白磷酸化与细胞周期（S、G2、M期磷酸化，G0,G1去磷酸化抑制细胞增殖）；

(2)Rb蛋白对转录因子E2F的（G1/S、S期Rb磷酸化与E2F解离，细胞增殖）；

(3)Rb蛋白与其他蛋白的作用（c-myc，c-fos）4、Rb蛋白在细胞分化及个体发育中的作用。

3、试述cAMP信息传递途径。

cAMP－PKA 途径-活化：①信号分子与受体结合，引起受体构象变化②受体活化G蛋白（结合GTP，α与βγ解离）③活化后的G蛋白激活腺苷酸环化酶（AC）④AC催化ATP生成cAMP⑤cAMP活化PKA（依赖cAMP的蛋白激酶）⑥PKA使目标蛋白磷酸化，调节代谢酶的活性或调节基因的表达

cAMP－PKA途径-失活：信息分子与受体解离，受体失活→G蛋白失活（GTP被水解成GDP，αβγ亚基重新聚合）→AC失活→cAMP被磷酸二酯酶水解→PKA失活。

4、试述PCR基本原理；

依据DNA半保留复制的机理；体外DNA分子于不同温度下可变性和复性的性质。

作为引物的一对寡核苷酸与模板DNA同源序列按照碱基互补配对原则形成局部双链，然后在TaqDNA聚合酶作用下引导新链DNA的合成，经过25-30个变性、退火和延伸的循环，获得特异性的DNA片段扩增产物。         

5、真核生物和原核生物基因组的特点；

1、原核基因组的特点：

①原核生物基因组通常仅由一条环状双链DNA分子组成；

②操纵子结构是原核生物基因组的结构特点之一：原核生物的绝大多数结构基因按功能相关性成簇地串联排列与染色体上，构成信息区，连同其上游的区（包括启动子和操纵基因）以及下游的转录终止信号构成一个基因表达单位，即操纵子结构。一个操纵子只含一个启动序列和数个可转录的结构基因。在同一个启动序列控制下，操纵子可转录出多顺反子mRNA。

③基因密度非常高，基因组序列中编码区所占的比例较大。可表达基因约50%，大于真核生物小于病毒。重复序列很少。

④在原核生物基因组中的非编码区内主要是一些序列。

⑤基因一般是连续的，无内含子；

⑥细菌基因组中的可移动成分能产生转座现象。

2、真核基因组的特点：

①真核生物基因组远大于原核生物基因组，结构复杂，基因数庞大，具有多个复制起点；

②基因组由染色体DNA和染色体外DNA组成。

③真核基因为单顺反子，而细菌和病毒的结构基因多为多顺反子；

④基因组中非编码区多于编码区；

⑤真核基因多为不连续的断裂基因，由外显子和内含子镶嵌而成；

⑥存在大量的重复序列；

⑦功能相关的基因构成各种基因家族；还存在一些假基因；

⑧存在可移动的遗传因素；

⑨体细胞为双倍体，而精子和卵子为单倍体。

6、反式作用因子结构域模式极其特点；

反式作用因子结构域具有多种结构模式：

1、DNA结合域有不同的结构模式：①锌指结构借助半胱氨酸和组氨酸与锌离子结合；②同源结构域具有螺旋－回折－螺旋结构：许多反式作用因子结合DNA的结构域中具有一段相同的保守序列，是60个左右氨基酸组成的螺旋－回折－螺旋结构的区域，称为同源结构域（homeodomain,HD）,简称同源域。③亮氨酸拉链结构使两个单体结合并形成DNA结合域。④螺旋-环－螺旋结构易于形成二聚体⑤碱性α-螺旋含较多的碱性氨基酸。2、转录活化结构域是反式作用因子的转录激活区。其模型有：①酸性α-螺旋结构。带有负电荷的α-螺旋区。②富含谷氨酰胺结构域存在于多种转录因子中。③富含脯氨酸结构域 常与DNA结合结构域相连。

反式作用因子三个基本特征

①一般具有三个功能域：DNA识别结合域、转录活性域和结合其他蛋白结合域；

②能识别并结合上游区中的顺式作用元件；

③对基因的表达有正性或负性作用，激活和阻遏基因的表达。

7、DNA 聚合酶的功能；

一、DNA聚合酶（DNA Polymerase）

1、DNA polymerase I （全酶，Kornberg polymerase）具有至少3种活性： 5’3’聚合酶活性；5’ 3’外切酶活性；3’ 5’外切酶活性。

2. 第二cDNA链合成

3. 对双链DNA3’突出末端进行末端标记；

4. Sanger 测序，

二、大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰklenow片段：5’3’聚合酶；3’ 5’外切酶；缺失5’3’外切酶活性 

8、以乳糖操纵子例，说明细菌基因表达的原理；

1、乳糖操纵子（lac operon）的组成：大肠杆菌乳糖操纵子含Z、Y、A三个结构基因，分别编码半乳糖苷酶、透酶和半乳糖苷乙酰转移酶，此外还有一个操纵元件O，一个启动子P和一个调节基因I（是调节基因，编码产生阻遏蛋白）。

2、阻遏蛋白的负性调节：没有乳糖存在时，I基因编码的阻遏蛋白结合于操纵序列O处，抑制RNA聚合酶与启动子结合，乳糖操纵子处于阻遏状态，不能合成分解乳糖的三种酶；有乳糖存在时，乳糖作为诱导物诱导阻遏蛋白变构，不能结合于操纵序列，乳糖操纵子被诱导开放合成分解乳糖的三种酶。所以，乳糖操纵子的这种机制为可诱导的负。

3、CAP的正性调节：lac启动子是弱启动子，在启动子上游有CAP结合位点，当大肠杆菌从以葡萄糖为碳源的环境转变为以乳糖为碳源的环境时，cAMP浓度升高，与CAP结合，使CAP发生变构，CAP结合于乳糖操纵子启动序列附近的CAP结合位点，激活RNA聚合酶活性，促进结构基因转录，调节蛋白结合于操纵子后促进结构基因的转录，对乳糖操纵子实行正，加速合成分解乳糖的三种酶。

4、协调调节：乳糖操纵子中的I基因编码的阻遏蛋白的负与CAP的正两种机制，互相协调、互相制约。

10、DNA损伤因素及机制。 

1、紫外线引起DNA损伤：①形成胸腺嘧啶二聚体②引起DNA之间的交联、DNA与蛋白质的交联、甚至DNA链的断裂。

2、电力辐射引起DNA损伤：①可导致碱基变化：由.OH自由基引起，包括DNA链上的碱基氧化修饰、过氧化物的形成、碱基环的破坏和脱落等②可导致脱氧核糖的变化：脱氧核糖分解，最后可引起DNA链断裂。③可导致DNA断裂：使脱氧核糖破坏或磷酸二酯键断开。④引起DNA链交联：包括DNA-DNA链间链内交联和DNA-蛋白质交联。

3、烷化剂引起DNA损伤：①烷化剂导致碱基烷基化②烷化剂导致碱基脱落③烷化剂导致DNA断链④烷化剂导致DNA链交联

4、碱基类似物、修饰剂引起碱基对的改变

5、其他因素：丫啶类化合物引起碱基插入和碱基缺失；氧自由基。

6、DNA也会产生自发性损伤：①DNA复制时产生碱基错配；②DNA修复使产生碱基错配；③碱基自发改变导致DNA损伤：互变异构位导致DNA突变；脱氨基作用导致DNA突变；碱基丢失导致DNA突变。

11、良好载体的条件

1、必须有自身的复制子；

2、载体分子上必须有性核酸内切酶的酶切位点,即多克隆位点,以供外源DNA插入；

3、载体应具有可供选择的遗传标志,以区别阳性重组子和阴性重组子；

4、载体分子必须有足够的容量；

5、可通过特定的方法导入细胞；

6、对于表达载体还应具备与宿主细胞相适应的启动子,前导顺序,增强子,加尾信号等DNA元件.

12、何谓基因工程？试述其产生的背景与研究内容。

基因工程(genetic engineering)：有目的地通过分子克隆技术，利用克隆基因表达、制备特定的蛋白或多肽产物，或定向改造基因结构所用的方法及相关的工作统称为基因工程。

基因工程的研究内容：

1.目的基因的获取：从生物有机体的基因组中分离带有目的基因的DNA片段；

2.重组：在体外将带有目的基因的DNA片段连接到能自我复制并具有选择标志的载体分子上，形成重组分子；

3.将重组分子导入受体细胞（细菌）:K-12。

4.带有重组子的细菌扩增，获得大量的繁殖群体。

5.筛选：从大量的细胞繁殖群体中筛选出带有重组DNA分子的克隆。

6.分析和表达：将选出的细胞克隆的目的基因进行进一步分析并实现功能蛋白的表达

13、当DNA损伤后，P53如何发挥其潜在的抑癌作用。

P53基因：位于染色体17p13.1，约20kb，含11个外显子，产物为p53，半衰期短，仅10分钟左右，在细胞内含量低。

P53蛋白的三个结构域：氨基端结构域具有促进基因转录的作用；120-290区域具有特异的DNA序列结合能力；羧基端含有定位于细胞核的信号、CDK磷酸化位点等。

细胞DNA受损时，可由于p53 蛋白半衰期延长和p53蛋白活化，导致p53 蛋白水平升高。

1、促进p21蛋白表达，细胞停留于G1期

P21抑制cyclin-CDK 活性，RB磷酸化少结合E2F，E2F不能作用于靶基因表达DNA合成酶，阻止细胞从G1期进入S期

2、促进GADD45蛋白表达，修复损伤的 DNA。

3、促进Bax、IGF-BP3、Fas的表达，诱导细胞凋亡。

16、当DNA损伤时， P53如何调节DNA修复？

DNA损伤活化Chk2 P53磷酸化P53降解抑制，P53含量升高

  （1）p21表达增加抑制cyclin-Cdk1 G1、 G2停滞。

  （2）14-3-3表达增加，Cdc25C停留于胞质，G2停滞。

20、原癌基因活化的机制：

(1)点突变；(2)基因扩增；(3)基因重排；(4)染色体易位；

(5)病毒基因启动子及增强子的插入；(6)癌基因的协同作用。

21、基因治疗的策略和技术方法

（一）基因治疗的主要策略

   1、基因置换（gene replacement)或称基因矫正（gene correction）：用正常的基因置换基因组中的缺陷基因，不影响整个基因组的结构。

2、基因添加（gene augmentation）或称基因增补：不去除异常基因，而是通过外源基因非定点的整合，使其表达正常产物，从而补偿缺陷基因的功能。

     两种类型：（1）补偿缺陷基因的功能；（2）导入靶细胞本身不表达的基因，利用其表达产物达到治疗目的。

3、基因干预：采用特定方式抑制某个基因的表达，或者通过破坏某个基因而使之不能表达，以达到治疗疾病的目的。

     如利用反义RNA、核酶、小干扰RNA等抑制或降解相应的mRNA，或导入自杀基因，使细胞“自杀”。

（二）基因干预的几种方法    

1、 反义RNA（antisence RNA)：能与mRNA（或其它RNA）互补配对的RNA分子。

    由于核糖体不能翻译双链的RNA，所以反义RNA与mRNA特异性的互补结合, 即抑制了该mRNA的翻译。

2、核酶：具有催化活性的RNA, 即化学本质是核糖核酸(RNA), 却具有酶的催化功能。 

3、 RNA干扰（RNA interference，RNAi）：是指由短双链RNA诱导的同源mRNA的降解过程，可使特定基因表达受到抑制。

原理：双链RNA 激活Dicer，识别异常的双链RNA并将其切割成短双链RNA（siRNA，21-23bp）， siRNA与 酶复合物（由核酸内切酶和解旋酶等组成）结合形成RNA诱导沉默复合物（RISC），双链RNA经解旋酶作用，成为单链RNA，识别并结合靶RNA分子，致核酸内切酶的切割，失去编码蛋白质的功能。

4、自杀基因技术：又称为前体药物酶转化基因，可将无毒的前体药物代谢为细胞毒性药物，使导入自杀基因的细胞“自杀”。

    常见的有HSV-tk/GCV系统、CD/5-FC系统。 

22、目前基因诊断方法有哪些？

（一）核酸分子杂交

    选用已知序列的核酸片段作为探针，经放射性核素或非放射性物质标记后，与未知的待测核酸进行杂交反应，分离已杂交和未杂交的标记核酸片段，通过标记信号的检测就可以对未知的待测核酸进行定性、定量分析。

核酸分子杂交的主要类型

      （1）Southern blot 杂交；

      （2）Northern blot  杂交；

      （3）斑点杂交；

      （4）原位杂交；

      （5）DNA芯片技术

（二）PCR技术

（三）单链构象多态性分析（SSCP)

      SSCP是一种简便检测核酸序列中点突变的技术，单个或多个碱基的突变可影响单链核酸分子的构象，在非变性聚丙烯酰胺电泳时，不同构象的核酸分子常表现出不同的迁移率，电泳新条带的出现反映了突变分子的存在。

（四）DNA分子多态性分析

      在人群中，个体间DNA序列存在着差异，称为DNA多态性。其中一些突变发生在性核酸内切酶的识别位点上，若用相关的性核酸内切酶切割基因组DNA，就会产生长度不同的片段，称为性片段长度多态性（restriction fragment length polymorphism, RFLP）。

       此外还有数目可变串联重复多态性（VNTR）、单核苷酸多态性（SNP）、Alu I序列多态性等。

（五）性核酸内切酶酶切图谱分析

（六）DNA序列测定

24、IP3、DG在信号转导中的作用；

由PIP2水解产生的IP3是水溶性的小分子物质，离开细胞膜后能在细胞质内很快地扩散， IP3与内质网膜上的特异Ca2+-通道结合后，就能使内质网腔里的Ca2+释放到细胞质，而且释放的Ca2+具有正反馈效应，即释出的Ca2+结合到Ca2+通道，再促进Ca2+释放。

DG的重要作用是激活蛋白激酶C(protein kinase C, PKC)，PKC是一类Ca2+依赖的蛋白激酶，能使选择性的靶蛋白的丝氨酸/苏氨酸残基磷酸化。因IP3作用升高的细胞质内Ca2+能使PKC从细胞质转移到细胞膜胞质面。在Ca2+，DG和细胞膜磷脂成分中的磷脂酰丝氨酸的共同作用下激活PKC。哺乳动物中脑细胞的PKC浓度最高，其作用是使神经细胞的离子通道蛋白磷酸化，从而改变神经细胞膜的兴奋性。在许多细胞中，PKC能通过激活磷酸化级联反应，最后使一些转录因子磷酸化并激活，从而相关基因的表达。

25、酵母双杂交原理

酵母双杂交系统的建立得力于对真核细胞转录起始过程的认识。研究发现，许多真核生物的转录激活因子都是由两个可以分开的、功能上相互的结构域(domain)组成的。例如，酵母的转录激活因子GAL4，在N端有一个由147个氨基酸组成的DNA结合域(DNA binding domain,BD)，C端有一个由113个氨基酸组成的转录激活域(transcription activation domain,AD)。GAL4分子的DNA结合域可以和上游激活序列(upstream activating sequence，UAS)结合，而转录激活域则能激活UAS下游的基因进行转录。但是，单独的DNA结合域不能激活基因转录，单独的转录激活域也不能激活UAS的下游基因，它们之间只有通过某种方式结合在一起才具有完整的转录激活因子的功能。下载本文