一、细胞及培养

    1． Marc145细胞

上皮样细胞，来源于猴肾细胞，从母细胞（MA 104细胞）克隆而得到，可连续培养。

    2． 生长培养基

    DMEM（高糖型，含4500mg/L D－葡萄糖、L-谷氨酰胺，和110mg/L丙酮酸钠，不含碳酸氢钠）＋

    ５％～10％新生牛血清+ 1％双抗（青霉素和链霉素）的培养液。

    3． 冻存液

    生长培养基＋10％ DMSO

    4． 细胞健康生长的几项注意事项

    1）细胞没有支原体等外源因子的感染。

    2）培养液的pH值可在7.0－7.3，以7.2为佳。

    3）一般按1：3传代，细胞接种密度为1－1.5×105cells/ml，48hr后长成单层。

    4）培养基和血清的质量可靠、稳定；建议采用特级小牛血清。

    5）细胞及时传代，不可以在老化后传代，一般在刚长成细胞单层时进行传代、扩增。

    6）细胞传代时消化液用0.25％胰蛋白酶+0.03％EDTA，消化过程应尽量缩短在1～2分钟内完成。

二、病毒感染、维持和收获

    转瓶中细胞长成单层后，弃瓶内细胞生长液，接种PRRS病毒。37℃吸附1hr，加入维持液，置37℃恒温室转瓶机上旋转培养3－5天。

    维持液：DMEM+4～5％新生牛血清。

    pH应为7.4～7.8；后期维持pH会慢慢降下来。

    细胞病变时间出现在接毒后48小时，72～96小时细胞病变达80％左右，当细胞出现80%以上病变（CPE）时，即可开始收毒；反复传过几代后病变时间可缩短。

    第3、4天注意观察，细胞病变（CPE）达到80％时收获病毒，－20℃冻融3次，混匀病毒悬液，96孔板测定TCID50。

收液时需要将含毒细胞反复冻融2～3次以破碎细胞，将病毒释放到培养液中。

三、细胞病变（CPE）

    细胞在接种病毒后，24－48hr开始出现病变，72－96hr约达到80％病变。病变现象：细胞空泡化、圆缩、先灶状脱落，再大片脱落，最后整个细胞裂解、破碎。图1是长成单层的marc 145细胞，图2、图3和图4均是指PRRSV感染后，出现细胞病变的Marc 145细胞。

图1 健康的Marc145细胞

图2

北京清大天一生物技术有限公司    

图3

图4

图2、图3和图4均是出现CPE的Marc 145细胞

四、PRRS病毒在细胞中增殖规律（ Virology Journal, 2006, 3: 90）

    PRRS病毒感染Marc 145细胞过程可大致分为两个感染阶段，第一阶段：病毒感染细胞后的20－22hr左右，仅部分细胞被随机感染，而且Marc 145细胞对PRRS病毒的低感染性（low permissiveness）与MOI量无关，因为MOI剂量比常规量提高100倍，感染22hr后，仍仅5.5％的细胞呈PRRSV阳性（PRRSV-positive）。第二阶段：感染后的2－3天（也称为病毒的对数感染期），病毒感染蔓延是通过相邻细胞和细胞之间的接触感染，细胞对自由病毒不敏感（Cells is nonpermissive to free Virus），并出现了感染细胞群。 感染过程如图5所示。

    对我们的一点启示：可以采用适当低量的MOI进行病毒感染，比如0.05virus/cell；同时，大部分细胞在维持期的第一天尚需继续生长，而且病毒在2－4天才是感染、增殖的高峰，较长的病毒维持期均需要供给丰富的营养物资，可以相信：维持液的营养成分对病毒增殖效率有非常重要的影响。 

图5 荧光抗体染色显微法观察PRRS病毒感染Marc 145细胞过程，A指PRRS病毒感染24hr，B和 C指PRRS病毒感染后42－46hr，D指PRRS病毒感染后72hr。下载本文