一.引物设计原则

首先引物与模板的序列要紧密互补，其次引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构，再次引物不能在模板的非目的位点引发DNA聚合反应(即错配)。

二.引物设计注意的要点

1. 引物的长度一般为15-30 bp，常用的是18-27 bp，但不应大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于Taq DNA聚合酶进行反应。 

2. 引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3’端相似性较高的序列，否则容易导致错配。引物3’端出现3个以上的连续碱基，如GGG或CCC，也会使错误引发机率增加。 

3. 引物3’端的末位碱基对Taq酶的DNA合成效率有较大的影响。不同的末位碱基在错配位置导致不同的扩增效率，末位碱基为A的错配效率明显高于其他3个碱基，因此应当避免在引物的3’端使用碱基A。另外，引物二聚体或发夹结构也可能导致PCR反应失败。5’端序列对PCR影响不太大，因此常用来引进修饰位点或标记物。 

4. 引物序列的GC含量一般为40-60%，过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。 

5. 引物所对应模板位置序列的Tm值在72℃左右可使复性条件最佳。Tm值的计算有多种方法，如按公式Tm＝4(G+C)＋2(A+T)，在Oligo软件中使用的是最邻近法(the nearest neighbor method)。 

6. ΔG值是指DNA双链形成所需的自由能，该值反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性。应当选用3’端ΔG值较低（绝对值不超过9），而5’端和中间ΔG值相对较高的引物。引物的3’端的ΔG值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发DNA聚合反应。 

7. 引物二聚体及发夹结构的能值过高（超过4.5kcal/mol）易导致产生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使PCR反应不能正常进行。 

8. 对引物的修饰一般是在5’端增加酶切位点，应根据下一步实验中要插入PCR产物的载体的相应序列而确定。 

三.引物设计的步骤

1.打开NCBI的主页，选择UniSTS,填写目的基因，选择符合要求的引物，导入blast和primer5检测是否符合要求，如果不符合要求再自己重新设计。

2.打开NCBI页面，选择Gene,填写需要查找的基因及源种（例如小鼠mus）,找到mRNA的序列号，点击打开，找到相应的mRNA，把序列或者mRNA的accession序号导出到word里面，找出含有内含子的位置，做好标记(从进入Gene页面后，点击Genbank,可以了解这个基因的大小，以及内含子与外显子的大小)或者把mRNA的accession序号导入priemer

Designing tool里面，扩增产物是200-250（100-250），TM 58-62（60±3），至少包含一个内含子，内含子长度可慢慢调试，最终要求Tm,GC%都比较接近，同时self3complementarity的值不能超过3，self complementarity不能超过6，这2个值越低越好。

3.根据引物设计原则，从mRNA序列中找相应的序列作为引物，上引物是5到3，下引物就是与mRNA序列反向互补的。

4.把设计的引物导入blast里检测下在所有基因中是否有非特异性扩增。

5.把全部mRNA序列导入primer5中，查看引物的Tm,GC%含量，是否有发夹结构与二聚体结构，以及错配率，得分，确定引物的可用性。

6.去NCBI上，查找该基因，物种分类小鼠，然后找到该基因的mRNA，拉出它的CDS，在它前后设计引物即可。记得BLAST下载本文