康从民，张德华，孙宗彬，王新宇
(青岛科技大学化工学院，青岛 266042)
[摘要] 胸苷酸合成酶(TS)和二氢叶酸还原酶(DHFR)在肿瘤、病菌的化学治疗中都是重要靶点，已有多种抑制剂应用于临床。近年来，随着对TS和DHFR作用机制和抑制剂药物的耐药机制的不断阐明，人们设计和合成了一系列新的抑制剂，其中双抑制剂成为研究的热点。现对胸苷酸合成酶和二氢叶酸还原酶抑制剂药物临床应用进行综述，并介绍胸苷酸合成酶和二氢叶酸还原酶双抑制剂的研究进展。
[关键词] 胸苷酸合成酶，二氢叶酸还原酶，双抑制剂
[中图分类号] R979.1 [文献标识码] A [文章编号]
Current status of dual thymidylate synthase and dihydrofolate reductase inhibitors
KANG Cong-min, ZHANG De-hua, SUN Zong-bin, WANG Xin-yu
(College of Chemical Engineering, Qingdao University of Science and Technology, Qingdao 266042 ,China)
[Abstract] Thymidylate synthase(TS) and dihydrofolate reductase(DHFR) both are important targets in chemotherapy of tumors and pathogens. A number of their inhibitors have been applied to the clinical. With the mechanisms of those two enzymes and the resistance mechanisms of their inhibitors been clarified, an array of new inhibitors have been designed and synthesized, especially, dual thymidylate synthase and dihydrofolate reductase inhibitors have became a hotspot for treatment research. The clinical application of thymidylate synthase and dihydrofolate reductase inhibitors and the current available their dual inhibitors are discussed in this paper.
[Key words] thymidylate synthase; dihydrofolate reductase; dual inhibitors
胸苷酸合成酶(thymidylate synthase, TS)和二氢叶酸还原酶(dihydrofolate reductase, DHFR)是合成DNA的必需前体物胸腺嘧啶脱氧核苷(dTMP)的关键酶，在细胞增殖中起着重要的作用，是肿瘤和传染性疾病如疟疾等化学治疗的重要靶点[1,2]。胸苷酸合成酶催化尿嘧啶脱氧核苷(dUMP)和亚甲基四氢叶酸反应生成胸腺嘧啶脱氧核苷(dTMP)和二氢叶酸[3,4]。二氢叶酸还原酶在烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)的存在下催化二氢叶酸还原为四氢叶酸[5]。因此，抑制DHFR、TS或者同时抑制二者能导致细胞“嘧啶缺失性死亡”(“thymineless death”)[6]，就能抑制DNA的生物合成进而抑制细胞生长或增殖。
通过抑制TS和DHFR而阻断DNA的生物合成，进而抑制肿瘤细胞、微生物和原生动物的增殖和生长，临床上分别有抗肿瘤、抗菌和抗原虫的功效[7,8]，因此TS和DHFR成为是化学治疗研究，特别是肿瘤化学治疗研究中非常有吸引力的靶点。近年来研究者已经设计和合成了多种TS和DHFR的抑制剂，有些抑制剂已应用于临床，包括雷替曲塞(Raltitrexed, ZD1694)[9]、培美曲塞(Pemetrexed, Alimta, LY231514)[10]、甲氨蝶呤(Methotrexate, MTX)[11]和诺拉曲塞(Nolatrexed, AG337)[12]等，曹胜利等[13]对其做过报道。
大多数物种的TS和DHFR是高保守存在的单功能酶，但二者在结构和存在位置上也有许多共同性。在原生动物中TS和DHFR却是表达在一个多肽上的双功能酶，研究表明这种双功能的DHFR-TS能表达出DHFR和TS双活性的奇特功能[7,14]。近年来随着TS和DHFR作用机制的不断阐明，DHFR-TS双抑制剂成为研究的新热点，研究者已设计和合成了多种DHFR-TS双抑制剂。现简要介绍TS和DHFR抑制剂临床应用上存在的问题及近年来TS-DHFR双抑制剂的研究进展。
1 TS和DHFR抑制剂的临床应用
临床上应用的TS和DHFR抑制剂对多种实体瘤，如直肠癌、恶性胸膜间皮瘤和非小肺细胞癌、头颈部肿瘤、肝癌等有很好的治疗效果；对病菌感染性疾病，如疟疾等也有一定的疗效。但其在应用中也出现了耐药性和毒副作用。大多数TS和DHFR抑制剂都是叶酸类似物，大致分为两类。一类含谷氨酸残基，属于经典的TS或DHFR抑制剂；另一类没有谷氨酸残基，属于非经典的TS或DHFR抑制剂。
经典的抑制剂要经过细胞膜上的还原叶酸载体蛋白(RFC)的转运才能进入细胞，在叶酸聚谷氨酸合成酶(FPGS)的催化下聚谷氨酸化。这类抑制剂的耐药性和毒副作用主要与这两个过程有关。
经典抑制剂药物分子进入细胞需要以RFC作载体，而长时间用药造成细胞RFC系统的损伤，使之不能进入肿瘤细胞发挥作用，从而产生耐药性[16]。Costi等[15]发现这类抑制剂是FPGS的底物。经典的抑制剂在细胞内的聚谷氨酸化过程往往导致TS和FPGS的过分表达，使药物在细胞内的浓度增加，延长了药物在细胞内的滞留时间，增强与TS或DHFR的结合性，从而增强其对TS或DHFR的抑制作用。但其在细胞内的滞留时间过长，导致其对正常细胞也产生较大毒性，这是临床应用时产生毒副作用的主要原因。
ZD9331、AG337等不含谷氨酸残基，属于非经典抑制剂，进入细胞不需要聚谷氨酸化，其中ZD9331需要RFC转运进入细胞，AG337则这两个过程都不需要，这样就有效地提高了药效，降低了毒副作用。因而，非经典抑制剂的这一特点使其有效地降低了耐药性和毒副作用，从而提高了疗效[17]。
肿瘤、病菌的耐药性和细胞毒性了经典的抑制剂的使用。人们以ZD9331的作用模式为启发设计合成了亲脂的非典型抑制剂，可以有效地克服这一缺陷。亲脂的非经典的抗叶酸类抑制剂不仅有非经典抑制剂的特点，而且还是亲脂性的，使之可以以被动转运的形式进入细胞，不需要RFC。亲脂非经典抑制剂的这些优点，使之成为抗叶酸类抗肿瘤和抗菌药物的重要研究方向。同时，TS-DHFR双抑制剂也可有效地克服耐药和毒性等缺陷，使之成为研究热点。
2 TS-DHFR双抑制剂模型
TS-DHFR双抑制剂是指一个抑制剂同时具有胸苷酸合成酶抑制活性和二氢叶酸还原酶抑制活性。这种双抑制剂在两个不同的位点(TS和DHFR)上同时起作用，能够单独使用而起到联合化学治疗的作用，而且没有两个或多个药物同时使用的药代动力学缺点，避免一些副作用。这种策略还能改进抗叶酸剂存在的生理毒性问题，大大降低了其对正常组织的伤害。因此，TS-DHFR双抑制剂成为抗叶酸类药物研究的一个新方向。
随着X射线衍射技术广泛用于生物大分子三维结构的测定，人们测定了TS和DHFR的三维结构，揭示了抑制剂与酶在活性位点区域的结合情况，发现TS和DHFR抑制剂的药效团模型。TS抑制剂一般都具有2-氨基-4-氧代或2-甲基-4-氧代嘧啶环结构，如Nolatrexed；而DHFR抑制剂通常在嘧啶环结构上有2,4-二氨基，如Methotrexate等，如图1所示[18]。
酶的晶体结构测定后，Gangjee等发现拥有六元并五元环的经典的叶酸类似物可以与相应的酶以“正常”模型或“旋转”模型结合[18,19]，如图2所示。“正常”模型是2-氨基-4-氧代嘧啶环结构模式，是TS抑制剂模型，如果以C2-NH2为轴翻转180°，则转变为2,4-二氨基嘧啶环模式，成为DHFR抑制剂模型，这类化合物就同时具备了2-氨基-4-氧代和2,4-二氨基结构特征，因而使之具有TS-DHFR双抑制活性。这个双抑制模型阐释了双抑制原理和双抑制剂的设计思路，近年来研究者以此思路设计和合成了多种TS-DHFR双抑制剂，其结构如图2所示。
TS抑制剂 DHFR抑制剂
图1 TS和DHFR抑制剂模型
“正常”模型 “旋转”模型
图2 TS-DHFR双抑制剂模型
3 呋喃并[2,3-d]嘧啶类双抑制剂
根据双抑制模型和Pemetrexed的结构，上世纪90年代人们就已经设计和合成了TS-DHFR双抑制剂，首先报道出来的是呋喃并[2,3-d]嘧啶类化合物。1994年Gangjee[20]等以经典型的2,4-二氨基呋喃并[2,3-d]嘧啶类化合物1a和1b及其非经典类似物1c-1f作为TS-DHFR双抑制剂进行了研究，2006年又做了进一步研究报道[21]。这类化合物在正常状态下是DHFR抑制剂，而以C2-NH2为转轴旋转180°变成2-氨基-4-氧代结构，变成TS抑制剂。生物活性研究表明，1a和1b只有中等的DHFR抑制活性，对人DHFR的IC50值分别为450和220nM；对人TS抑制活性较差，其IC50值大于200μM。非经典类似物1c-1f对TS和DHFR的抑制活性都较差。这类抑制剂的TS-DHFR双抑制的活性虽然很低，但这种设计思路为以后设计活性更高的双抑制剂提供了指导。
4 吡咯并[2,3-d]嘧啶类双抑制剂
在2001年Taylor[22]和Aso[23]就已经分别报道了吡咯并[2,3-d]嘧啶类化合物，并作为TS抑制剂进行了研究。2005年Gangjee等[18]将这类化合物的结构进行改造，设计合成2a和2b作为经典的TS-THFR双抑制剂，并进行了生物活性测定。结果表明2a和2b都是较好的TS-DHFR双抑制剂。2a是首个经典的2,4-二氨基吡咯并[2,3-d]嘧啶类抗叶酸抑制剂，对TS和THFR有较好的抑制活性。2a对的DHFR抑制活性（IC50=210nM）是Pemetrexed的14倍，对人TS抑制活性(IC50=540nM)与Nolatrexed相当，比Pemetrexed高一个数量级。Raltitrexed和MTX分别只对TS和DHFR有好的抑制活性，而2a对这种两种酶均有良好的抑制活性。2b对大肠杆菌DHFR和TS、人DHFR和TS均显示出较差的抑制活性，但对鼠弓形虫DHFR和TS有中等抑制活性，所以2b是鼠弓形虫DHFR-TS的双抑制剂。
2006年，Gangjee等[24]设计了经典的吡咯并[2,3-d]嘧啶类化合物3a及13个非经典的类似物3b-3n作为TS-DHFR双抑制剂进行研究。3a-3n结构上与2a和2b比，主要是巯基取代在5、6位上顺序的替换。研究表明化合物3a是非常有效的人TS(IC50=90nM)和DHFR(IC50=420nM)双抑制剂，与2a相比，其对人TS抑制活性提高了5倍多，而对人DHFR的抑制活性也相当，而且3a不是FPGS的底物。非经典的类似物3b-3n只对人TS有抑制活性，但活性不高，其IC50值只在0.23-26μM之间。
图3 TS-DHFR双抑制剂结构
5吡咯并[3,2-d]嘧啶类双抑制剂
2008年，Gangjee等[16]设计了新的双抑制模型，即吡咯并[3,2-d]嘧啶模型，并设计合成了经典的吡咯[3,2-d]嘧啶类化合物4a和11个非经典类似物4b-4l作为TS-THFR双抑制剂进行了研究。从结构上看，吡咯并[3,2-d]嘧啶类与3类相比，只是五元环上N由7位移到5位，侧链连接到5位N上，硫桥改为碳桥。活性研究表明4a对TS-DHFR双抑制活性很高，对人TS的IC50值为46nM，其活性是Pemetrexed的206倍，比3a高；对人的DHFR的IC50值为120nM，是Pemetrexed的55倍，比3a提高了3倍多。因此，4a与Pemetrexed和3a相比是更好的双抑制剂。11个非经典的类似物4b-4l主要对人TS有较好的抑制活性，对人DHFR抑制活性较低，但对大肠杆菌的DHFR有很强的选择性抑制，与人的相比选择性高100多倍。
6 噻吩并[2,3-d]嘧啶类双抑制剂
Hafez[25]等报道噻吩并[2,3-d]嘧啶类化合物有很好的抑菌作用，具有抗炎、止痛和抗溃疡等疗效。2008年Gangjee等[26]对这类化合物的抗肿瘤活性进行了研究，将噻吩并[2,3-d]嘧啶结构作为新的TS-DHFR双抑制剂模型，如图4所示，并设计合成了一系列经典和非经典的2-氨基-4-羰基-5-芳基硫代-6-甲基噻吩并[2,3-d]嘧啶类化合物。在此结构中，将原来的五元环中的N替换为S变为噻吩结构，保留了侧链的硫桥。在此类化合物中5a是经典的抑制剂，生物活性研究表明它是目前为止所发现的活性最高的TS-DHFR双抑制剂。其对TS的IC50值为40nM，是Pemetrexed的237.5倍，比4a要高；对人DHFR的IC50值为20nM，是Pemetrexed的330倍，比4a高5倍。9个非经典的类似物5b-5j有中等的TS抑制活性，其IC50值在0.11到4.6µM之间，其中4-硝基苯基类似物5d对TS-DHFR双抑制活性最高，可作为双抑制剂进行进一步研究。研究者发现2-氨基-4-羰基-6-甲基噻吩并[2,3-d]嘧啶骨架非常有利于TS-DHFR双抑制活性，为以后进行临床研究和设计活性更高的双抑制剂打下了良好的基础。
2-氨基-4-氧代（TS）结合模型 2-氨基-4-硫代（DHFR）结合模型
图4 噻吩并[2,3-d]嘧啶的结合模型
7 结语
随着对TS和DHFR作用机理不断深入阐述，TS和DHFR越来越成为抗叶酸类药物研究的热门靶点，人们设计和合成出来越来越多的抑制剂。TS-DHFR双抑制剂模型的提出为此类抗肿瘤药物研究开辟了新的思路。从上世纪90年代呋喃并[2,3-d]嘧啶类双抑制剂到如今的噻吩并[2,3-d]嘧啶类双抑制剂，活性越来越高，很多已经远远超过上市的肿瘤治疗药，有些已进入临床研究或即将进入临床研究。这条双抑制剂设计思路也将为以后设计合成活性更高的抗肿瘤药物奠定基础。
[作者简介]康从民（1963-），男，博士，教授，主要从事药物分子设计与合成研究。联系电话：(0532)84023290，E-mail：cmkang@qust.edu.cn
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