(20分钟　50分)

1.(12分)(2015·赤峰模拟)高温淀粉酶在大规模工业生产中有很大的实用性。研究者从热泉中筛选了高效产生高温淀粉酶的嗜热菌，其筛选过程如下图所示。请回答下列问题：

(1)实验过程应采用无菌技术，防止培养物被微生物污染及　　　　　　　　被微生物感染，操作者的双手需要进行清洁和　　　　处理。

(2)Ⅰ、Ⅱ号培养基配制和灭菌时，灭菌与调节pH的先后顺序是　　　　　　　　。

(3)Ⅰ号培养基中的碳源为　　　　。若Ⅰ号培养基中的菌落连成一片，最可能的原因是　　　　　　　　　　　　。

(4)部分嗜热菌的菌落周围形成透明圈，应挑出透明圈　　　　　　(填“大”或“小”)的菌落接种到Ⅱ号培养基，该过程的目的是　　　　目的菌；下次划线时接种环上的菌种来源于　　　　　　　。

【解析】(1)微生物培养时，为了防止培养物被微生物污染及操作者自身被微生物感染，应采用无菌技术，对操作者的双手需要进行清洁和消毒处理。(2)培养基配制时，应先调节pH，然后灭菌处理。(3)从热泉中筛选高效产生高温淀粉酶的嗜热菌，应以淀粉作为碳源。若涂布平板时培养基中的菌落连成一片，最可能的原因是菌液浓度过高(或稀释不够)。(4)嗜热菌的菌落周围形成透明圈，透明圈越大，则表明该菌能更高效利用淀粉。Ⅱ号培养基上采用平板划线法接种，是为了纯化目的菌，下次划线时接种环上的菌种来源于上次划线末端。

答案：(1)操作者自身　消毒

(2)先调节pH，后灭菌

(3)淀粉　菌液浓度过高(或稀释不够)

(4)大　纯化　上次划线末端

【加固训练】多环芳烃菲在染料、杀虫剂等生产过程中被广泛使用，是土壤、河水中常见的污染物之一。下图表示科研人员从被石油污染的土壤中分离获得能降解多环芳烃菲的菌株Q的主要步骤。请回答：

(1)完成步骤④中操作，共需灼烧接种环　　　　次。该步骤的目的是对菌株Q进行　　　　　　　，为防止冷凝后形成的水珠滴落在培养基上污染培养基，固体平板培养细菌时要　　　　　。

(2)在培养基上形成的菌落在生态学上可以称为一个　　　　　　。

(3)为了获得分解多环芳烃菲能力更强的菌株，研究人员又对菌株Q进行了诱变处理，得到突变株K。为了进一步比较两种菌株降解多环芳烃菲的能力，设计了下列实验，请补全实验步骤：

①取9只锥形瓶均分成三组，编号A、B、C。

②向A、B、C三组锥形瓶中加入等量的　　　　　　的培养液。

③向A加入无菌水，B、C两组培养液中分别加入 　　　　　　　　　　　　

　　　　　　　　　　　　。

④28℃恒温培养3天后，测定锥形瓶中多环芳烃菲的降解率。

【解题指南】(1)关键信息：比较两种菌株降解多环芳烃菲的能力。

(2)知识储备：

①多环芳烃菲是含碳化合物，可作为微生物的碳源。

②平板划线接种时每次划线前后均要灼烧接种环。

【解析】(1)图中步骤④为平板划线操作，共在5个区域内划线，由于每次划线前后均要灼烧接种环，因此该操作共需灼烧接种环6次。为防止冷凝后形成的水珠滴落在培养基上污染培养基，固体平板培养细菌时要倒置。

(2)在培养基上形成的菌落是同种微生物的子细胞群体，因此在生态学上可以称为一个种群。

(3)实验的目的是比较两种菌株降解多环芳烃菲的能力，因此所用培养基应以多环芳烃菲为唯一碳源。对照实验分别用无菌水、等量的菌株Q菌液和突变株K菌液进行对照。

答案：(1)6　纯化　倒置　(2)种群

(3)以多环芳烃菲为唯一碳源　等量的菌株Q菌液和突变株K菌液

2.(12分)尿素是一种重要的农业肥料，但若不经细菌的分解，就不能更好地被植物利用。生活在土壤中的微生物种类和数量繁多，某同学试图从土壤中筛选出能高效降解尿素的细菌(目的菌)，表中所示是该同学配制的培养基成分：

(2)在微生物的培养中，一般要对配制的培养基采用高压蒸汽灭菌，其中“高压”是为了　　　　　　　　　　　　　　　　　。

(3)若培养从土壤中分离出来的目的菌，该培养基成分如何调整？　　　　　　

　　　　　　　　，依据是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。

【解析】(1)从培养基的成分看，该培养基中包含微生物生长所需的氮源[(NH4)2SO4]、碳源(葡萄糖)、水和多种无机盐，并且培养基中还有琼脂作为凝固剂，因此从物理性质上看，该培养基属于固体培养基。

(2)微生物的芽孢耐受性强，高压可以杀死培养基中的细菌芽孢。

(3)从土壤中分离降解尿素的细菌，应用以尿素为唯一氮源的选择培养基，因此应将该培养基中的(NH4)2SO4换成尿素。

答案：(1)氮源、碳源、无机盐和水　固体

(2)杀死培养基中的细菌芽孢

(3)将(NH4)2SO4换成尿素　要筛选出降解尿素的细菌，只能以尿素作为唯一的氮源

【加固训练】常见的酿酒酵母只能利用葡萄糖而不能利用木糖来进行酒精发酵，而自然界中某些酵母菌能分解木糖产生酒精，但是对酒精的耐受能力差。科学家利用基因工程培育了能利用这两种糖进行发酵且对酒精耐受能力强的酿酒酵母。

(1)将自然界中采集到的葡萄带回实验室，用无菌水将葡萄皮上的微生物冲洗到无菌的三角瓶中，然后将瓶中的液体用　　　　　　　　　　法接种于固体培养基上，在适宜的条件下培养，获得各种菌落。

(2)将培养基上的酵母菌菌株转接到 　　　　　　　　　的培养基中，无氧条件下培养一周后，有些酵母菌死亡，说明这些酵母菌不能利用木糖发酵。从存活的酵母菌中提取DNA，经大量扩增获得目的基因。

(3)将目的基因连接到质粒上，该质粒具有尿嘧啶合成酶基因，其可作为标记基因。将重组质粒导入酵母菌时，选择缺乏尿嘧啶合成能力的酿酒酵母作为受体菌，导入成功后，可用　　　　　　　的培养基筛选能够利用木糖的酿酒酵母。

(4)将上述获得的转基因酿酒酵母接种在以　　　　　　和　　　　　为碳源的培养基中进行发酵能力测试。随着发酵的持续进行，若该酿酒酵母能够存活，说明它能 　　　　　　　　　　　　　　　　，即说明所需菌株培育成功。

【解析】(1)在固体培养基上的接种方法有平板划线法和稀释涂布平板法。

(2)能够利用木糖的酵母菌能够在以木糖为唯一碳源的培养基上生长，因此可以设置以木糖为唯一碳源的培养基筛选能够利用木糖的酵母菌。

(3)由于质粒上具有尿嘧啶合成酶基因，因此导入重组质粒的酵母菌能够合成尿嘧啶，因此可用缺乏尿嘧啶的选择培养基筛选能够利用木糖的酿酒酵母。

(4)转基因酿酒酵母既能够利用葡萄糖，又能够利用木糖，因此可在含有葡萄糖和木糖的培养基上生长繁殖，随着发酵的进行，发酵液中酒精不断增加，如果酿酒酵母不死亡，则说明这些酿酒酵母对酒精的耐受能力强。

答案：(1)稀释涂布平板(或平板划线)

(2)以木糖为唯一碳源

(3)缺乏尿嘧啶

(4)葡萄糖　木糖　利用葡萄糖和木糖产生酒精，且对酒精的耐受能力强(合理即可)

【方法技巧】选择培养基的设计方法

(1)营养缺陷型选择培养基：通过控制培养基的营养成分，使营养缺陷型微生物不能正常生长。

(2)添加抑菌物质的选择培养基：在完全培养基中加入某些化学物质，利用加入的化学物质对非目的微生物产生的抑制作用选择目的微生物。

(3)特殊培养条件的选择培养基：改变微生物的培养条件(如高温、特殊pH等条件的选择)。

3.(11分)(2013·新课标全国卷Ⅱ)临床使用抗生素前，有时需要做细菌耐药实验。实验时，首先要从病人身上获取少量样本，然后按照一定的实验步骤操作，以确定某致病菌对不同抗生素的敏感性。

回答下列问题：

(1)为了从样本中获取致病菌单菌落，可用　　　　　法或　　　　　　　　　

法将样本接种于固体培养基表面，经过选择培养、鉴别等步骤获得。

(2)取该单菌落适当稀释，用　　　　　法接种于固体培养基表面，在37℃培养箱中培养24 h，使其均匀生长，布满平板。

(3)为了检测该致病菌对于抗生素的敏感性，将分别含有A、B、C、D四种抗生素的滤纸片均匀置于该平板上的不同位置，培养一段时间后，含A的滤纸片周围出现透明圈，说明该致病菌对抗生素　　　　　　　　　　　　；含B的滤纸片周围没有出现透明圈，说明该致病菌对抗生素B　　　　　　；含C的滤纸片周围的透明圈比含A的小，说明　　　　　　　　　　　　　　　　　　　；含D的滤纸片周围的透明圈也比含A的小，且透明圈中出现了一个菌落，在排除杂菌污染的情况下，此菌落很可能是抗生素D的　　　　　　　　　　。

(4)根据上述实验结果，为达到抗菌目的，最好应选用抗生素　　　　　。

【解题指南】本题主要考查微生物培养，解答本题可从以下两个方面着手：

(1)分离微生物方法：平板划线法和稀释涂布(平板)法。

(2)透明圈的大小表示此种抗生素抗菌能力的强弱。

【解析】本题考查微生物接种和抗生素抗菌能力判断。

(1)在微生物的培养过程中，常用来分离微生物的方法是稀释涂布(平板)法或平板划线法。

(2)为了使微生物在培养基上能够均匀分布，一般用涂布法将微生物接种在培养基上。

(3)在抗药性检验过程中，如果在菌落周围出现透明的圆圈，说明此种抗生素可抑制该细菌生长；透明圈的大小表示此种抗生素抗菌能力的强弱，据此可判断A、B、C抗菌能力强弱依次是A、C、B；D的透明圈中出现了一个菌落，说明该菌落对此种抗生素具有耐药性。

(4)实验结果表明抗生素A对该致病菌的抗菌效果最好。

答案：(1)划线　稀释涂布(平板)(或涂布)　(2)涂布

(3)敏感　不敏感　该致病菌对C的敏感性比对A的弱　耐药菌　(4)A

4.(15分)(2015·南昌模拟)无菌操作是微生物接种技术的关键；传统发酵技术和微生物分离、纯化、应用过程及植物组织培养和动物细胞培养过程中，均要无菌操作。回答下列相关问题：

(1)消毒和灭菌是两个不同的概念，灭菌是指彻底杀灭微生物使其永远丧失生长繁殖的能力。消毒仅指杀死一部分对人体有害的病原菌而对被消毒的物体基本无害。下列哪些事物适用于消毒处理　　　　。

①皮肤　　　②饮用水　　③牛奶　　　④注射器

⑤培养皿        ⑥接种环        ⑦培养基        ⑧果汁

⑨酱油        ⑩手术刀

A.①②③⑧⑨                        B.④⑤⑥⑦⑩

C.①②③④⑤⑥⑧                    D.以上全部

(2)配制培养基时各种成分在溶化后分装前必须进行　　　　　　，接种前要进行　　　　　　　　，在整个微生物的分离和培养中，一定要注意在无菌条件下进行。

(3)下图是利用　　　　法进行大肠杆菌接种，把聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面。为达到这一目的，操作上应注意：

①每次划线前要　　　　　　　　　　；

②冷却后从上一区划线末端开始划；

③首尾区　　　　　　　　　。

(4)利用培养基不仅可以分离培养大肠杆菌，也可以进行植物组织培养。与大肠杆菌培养明显不同的是，用于组织培养的培养基中还需要加入　　　　　　　。

(5)有位同学在家制作泡菜时，为避免杂菌污染而向泡菜坛中加入了青霉素，结果发酵失败，原因可能是　　　　　　　　　　　　　。

【解析】(1)皮肤、饮用水、牛奶、果汁、酱油应消毒处理，注射器、培养皿、接种环、培养基、手术刀应灭菌处理。

(2)配制培养基时各种成分在溶化后分装前必须调整pH，接种前要进行高压蒸汽灭菌，在整个微生物的分离和培养中，一定要注意在无菌条件下进行。

(3)微生物的接种方法有平板划线法和稀释涂布平板法。平板划线进行时应每次划线前灼烧接种环，冷却后从上一区划线末端开始划，首尾区不连接。

(4)与大肠杆菌培养明显不同的是，用于组织培养的培养基中还需要加入植物激素。

(5)制作泡菜利用的是乳酸菌的乳酸发酵，但乳酸菌对青霉素敏感，会导致死亡。

答案：(1)A　(2)调整pH　高压蒸汽灭菌

(3)平板划线　灼烧接种环　不连接(不重叠)

(4)植物激素　(5)青霉素杀死了乳酸菌

【加固训练】生物乙醇是以生物为原料生产的可再生能源。我国利用农作物废弃物(秸秆)生产乙醇，其技术流程为：纤维素酶分解→酵母菌发酵→蒸馏→成品。纤维素酶可以从能分解纤维素的细菌培养液中提取。某同学设计了从土壤中分离纤维素分解菌的实验流程：土壤取样→选择培养→梯度稀释→鉴别培养。请分析回答下列问题：

(1)最好选择　　　　　　　　　　　　环境采集土样。

(2)以下是两种培养基配方。

A.培养基配方

(3)为了鉴别纤维素分解菌和进一步纯化菌种，可以在鉴别培养基中加入　　　　　　，将筛选获得的菌液稀释后用　　　　法接种到鉴别培养基上，然后挑选产生　　　　的菌落作为菌种进行扩大培养。

【解析】(1)分解纤维素的微生物生活在富含纤维素的环境中，因此从土壤中分离纤维素分解菌时应从纤维素含量丰富的土壤取样。

(2)由培养基的配方可知，B培养基富含纤维素，因此要分离提纯土壤中的纤维素分解菌，应选择B培养基配方，该培养基属于选择培养基。

(3)鉴别纤维素分解菌的方法是刚果红染色法，即在鉴别培养基中加入刚果红染液，将筛选获得的菌液稀释后用涂布平板法接种到鉴别培养基上，纤维素分解菌的菌落周围会出现不变红的透明圈，因此有透明圈的菌落即为纤维素分解菌的菌落，可以作为菌种进行扩大培养。

答案：(1)纤维素含量丰富的土壤　(2)B　选择

(3)刚果红染液　涂布平板　透明圈

【延伸探究】怎样判断第(3)题中的选择培养基对微生物进行了选择？

提示：设置对照实验，对照实验将同样等量的土壤浸出液用同样的方法接种到牛肉膏蛋白胨培养基上，如果对照组菌落数量、种类多，即可说明该选择培养基对微生物进行了选择。

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