连亨宁

成都军区总医院呼吸内科，成都 610083

摘要：目的寻找简便的淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒LCMV病毒滴度测定方法。方法采用半数组织培养感染剂量(TCID50)法检测LCMV病毒滴度，记录期间细胞形态变化。结果实验后第5天获得与空斑实验一致的病毒滴度结果,但实验流程更为简单。结论 TCID50法测定LCMV病毒滴度相对于空斑实验更为简便。

关键词：半数组织感染剂量；空斑实验；淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒；病毒滴度

中图分类号：Q939.47文献标识码：A

The advantage of Lymphocytic Choriomeningitis Virusquantification by 50% Tissue culture infective dose

LianHengning

（Department of Respiratory Medicine， Chengdu Military General Hospital ，Chengdu 610083）

Abstract：To determine a convenient method to quantify Lymphocytic Choriomeningitis Virus (LCMV) ,LCMV titer was measured by the 50% Tissue culture infective dose (TCID50) method . The result was got 5 days post-infection , similar with plaque assay ,but the protocol is easier than plaque assay .This experiment showd that TCID50 is more convenient than plaques assay .

Key words:50% Tissue culture infective dose(TCID50);Plaques assay;Lymphocytic Choriomeningitis Virus (LCMV); Virus titer

空斑实验是检测病毒滴度最为经典的方法[1]。其原理为将病毒充分稀释后感染细胞，使用琼脂培养基将病毒感染局限于固定区域，若干天后病毒感染造成的细胞病变会形成空斑，1个空斑被认定为由1个病毒感染、扩散所致，由计算病毒滴度，其单位为PFU/ml（空斑形成单位）。TCID50法测定病毒滴度原理为，取出X体积病毒液感染组织，该X体积病毒液中有50%可能含有病毒，从而使组织发生感染。X的倒数即为病毒滴度，其单位为TCID50/ml[2]。TCID50法基于泊松分布的统计学原理，与空斑实验的换算关系为0.69 TCID50/ml≈1 PFU/ml。空斑实验测定的病毒滴度更为精确，而TCID50法所得数据更为可信、稳定。两种方法均为病毒滴度测定的常用方法，空斑实验运用更多，TCID50法则多用于细胞病变效应不明显的病毒滴度测定，如人免疫缺陷病毒（HIV）。淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒（LCMV）是进行T细胞耗竭研究的常用工具[3]，其滴度测定多采用空斑实验。本研究选择TCID50法测定病毒滴度，通过与空斑实验进行比较，其结果相近，但更为简便。

1 材料与方法：

1.1材料已知病毒滴度的LCMV病毒原液（第三军医大学万瑛教授馈赠，由空斑实验测定滴度1.3 X 107 PFU/ml），乳仓鼠肾细胞（BHK21细胞），细胞培养所需10培养基（含5%胎牛血清、1%青链霉素、1%谷氨酰胺）均为Hyclone公司产品，96孔板（Corning），相差显微镜（奥林巴斯）；

1.2 TCID法病毒滴度测定 BHK21细胞在培养瓶中生长至细胞密度80%时收获细胞，按每孔15000个细胞铺板，共6X8个孔，每孔含100 μl培养基；随后加入病毒稀释液，病毒原液使用培养基10倍梯度稀释，每个孔中加入100 μl病毒稀释液，每个梯度浓度加5个孔，共8个梯度，设8个孔为阴性对照，加入100 μl培养基。板布局见图1；

1.3 病毒滴度计算方法观察细胞病变的孔的数目及其所在病毒液浓度，使用Reed-Muench法计算病毒滴度，与空斑实验所得结论进行比较。

图1 板布局，数字代表每行病毒原液稀释倍数

Fig 1 Plate , the numbers mean the dilution fold of the virus

2 结果

每日使用相差显微镜观察平板，如图2所示，10-100倍稀释度实验孔感染病毒后96小时出现细胞病变，103—106倍稀疏度实验孔感染病毒后120小时出现细胞病变，持续观察1周，阴性孔未发生与对照孔不同的变化。统计数据，106倍稀释组5个实验孔中有3个孔出现细胞病变，2个孔未出现细胞病变，107倍稀释组及更高稀释度实验孔均未出现与对照孔不同的细胞形态变化。使用Reed-Muench公式计算病毒滴度为1.47 X 107 TCID50/ml≈1.01 X 107 PFU/ml，与空斑实验结论相似。

图2 阳性孔(10倍稀释)以及阴性孔细胞形态变化， P.I 感染后，h 小时

Fig2 cell morphology changes in positive well （10 fold dilution）and negative well , P.I post-infection , h hour

3 讨论

采用TCID50法所测病毒滴度与空斑实验结果基本一致，两者处在同一数量级水平，本实验每个梯度浓度有5个实验孔，若增加实验孔的数目，测定的滴度会趋近于真实值（不是空斑实验所测值）。因此可认为TCID50 和空斑实验均是测定LCMV滴度的有效、可信的方法。本实验中，细胞病变最晚发生在病毒感染后120小时，但培养基颜色的变化会在细胞病变发生之前出现，如图1所示为感染后96小时照片，106倍稀疏度实验孔尚未出现镜下的细胞病变，但培养基已开始变色。细胞病变出现剧烈，之前24小时细胞与对照孔细胞相比无形态学上可辨别的差异。

比较TCID50和空斑实验流程，如表1所示，前者相对于后者具有诸多优势，所需实验材料少，实际操作1次完成，空斑实验则需要3次完成。空斑实验由于操作繁琐，实验结果的观察容易受琼脂培养基铺板、染色的影响。虽然TCID50数学原理较为复杂，但借助Brett D. Lindenbach设计的软件Reed &Muench Calculator、可很好解决结果的计算问题。而且通过增加实验孔的数目，TCID50可以获得比空斑实验更为准确、可靠的结果。目前测定病毒滴度的新方法较多，如通过实时定量PCR、流式细胞分析术、酶联免疫斑点试验（ELISPOT）可迅速获得病毒滴度[4-6]。但TCID50 投入成本低，操作简单的优势是其他检测方法无可比拟的。

Tab 1 comparison of TCID50 and plaques assay in virus titer measuring

[1]    Rowe WP, Pugh WE, Hartley JW. Plaque assay techniques for murine leukemia viruses [J]. Virology, 1970, 42(4): 1136-1139.

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[6]    Wang W, Cheng T, Ma K, et al. Development of a novel baculovirus titration method using the Enzyme-linked immunosorbent spot (ELISPOT) assay [J]. Journal of virological methods, 2013, 188(1-2): 114-120.下载本文