因此，在使用间接法测定IgM抗体时，通常须将血清样本用抗人IgG抗体或SPA预处理，以去除IgG的干扰。这样不但测定较为繁琐，而且影响测定的特异性和灵敏度。目前，常用的IgM抗体检测方法为捕获法，即以抗人IgM抗体(抗人u链)作为固相抗体，当加入血清标本时，其中的IgM类抗体(特异的和非特异的)即可被固相抗体捕获，再加入特异抗原，其与固相上捕获的IgM抗体结合后，加入酶标抗特异抗原的抗体，最后加入底物显色。具体操作步骤如下：

    1．首先将抗人IgMbt链抗体于碳酸盐缓冲液中40c下过夜包被聚苯乙烯等固相，形成固相抗体，洗涤去除未与固相结合或结合不紧的抗体后，用小牛血清或牛血清白蛋白等封闭，洗涤去除未结合的部分及杂质。

    2．加入含待测IgM抗体的临床样本如血清等，温育一定时间后洗板；此时，待测样本中的IgM抗体就会与固相上的抗P链抗体反应而吸附于固相上。

    3．加入特异的抗原如HAV抗原、HBcAg等，温育一定时间后洗板；此时，特异抗原就会与固相上的特异IgM抗体发生反应。

    4．加入酶标记的抗特异抗原的抗体，温育一定时间后洗板；此时，在固相上即形成相应的抗原抗体复合物。

    5．加入酶底物，温育显色测定 

    本方法要着重注意的是RF(1gM类)及其他非特异IgM的干扰。RF(1gM类)由于其能与固相抗人u链抗体结合，并可与随后加入的酶标抗体(动物IgG)反应，从而导致假阳性反应。而非特异IgM由于其在第一步温育中，可与特异IgM竞争与固相抗体结合，所以会影响测定的灵敏度。因此，使用本法测IgM，必须对临床样本进行适当稀释。样本稀释后，上述产生干扰作用的非特异IgM含量减少，而特异IgM由于处于相应病原体的急性感染期，滴度很高，一定稀释后，不会有明显影响，况且，在某些病原体如HBV的慢性感染阶段，IgM类特异抗体也能持续存在，只不过滴度要低很多。

    因此，如不对血清样本稀释，就直接检测，即使是没有非特异IgM的干扰，阳性测定结果也没有急性感染的诊断价值。现在，有些试剂生产厂家，为了迎合临床实验室减轻劳动强度、简便操作的要求，生产了不需对样本进行稀释的抗HAVIgM和抗HBclgMELISA试剂盒，现有不少实验室也在使用。鉴于上面提到的原因，我们建议临床实验室在做抗HAVIgM和抗HBc lgM等类检测时，应使用对样本进行稀释的试剂盒，以保证检测的临床价值。 

    可见定性测定通常是用于传染性病原体的抗原或抗体的测定，以判断特定病原体感染的存在与否。而定量测定则是对标本中待测抗原的多少进行量值测定，以具体数值表示。定量测定基本上是用于非病原体抗原物质的测定，如激素、细胞因子、肿瘤标志物、小分子药物等。目前国内应用的ELISA试剂盒绝大部分是用于传染性病原体的抗原或抗体的定性测定，也有少部分用于。

    FP，hCG、细胞因子等的定量测定。ELISA定性测定的“阴性”和“阳性”的判定依据是试剂盒所确定的阳性判定值(cut-off)。定量测定的“量值”依据是试剂盒中所带标准品同时测定得出的剂量反应曲线(又称标准曲线)。

    实验室进行室内质控时使用。

    下面再解释一下在ELISA定性测定结果判定中常用的一些缩写：

    (1)S／CO：其中S为sample(样本)或specimen(标本)的简写，表示的是标本测定的吸光度值，CO为cut-off值的简写。除竞争抑制法外，其他ELISA定性测定模式中，当S／CO值大于或等于1时，标本的测定为阳性，小于1时为阴性。

    (2)S／N或P／N：其中S同(1)，N为negative(阴性对照)的简写，P为patient(患者)的简写。较早的试剂盒很多都使用S／N或P／N≥2．1为阳性判定标准，现仍有一些试剂盒使用这种方式。这种方式与S／CO方式无根本性区别，只不过是前者将阴性对照(N)的2．1倍视为cut-off值而已. 

   尽管如此，作为一项免疫检验技术，酶免疫试验还是有其局限性的，不但所检测的生物学体液样本如血清中有可能存在各种干扰实验的因素，而且在实验过程中，影响结果的因素也很多，尤其是进行手工的ELISA测定时。

    此外，在定性ELISA测定中，阳性判定值(CUT-OFF)的建立，是在一定的统计学基础上的，相对于某个具体的受检者来说，其有可能并不具备正确性。例如，使用ELISA方法检测抗HCV及抗HIV或HBsAg，有时候，检测所得的阳性结也许并不是真正的阳性，而需要使用其他方法如重组免疫印迹(recombinant immunoblot as—say，RIBA)、蛋白印迹(Westernbl。t，WB)或中和试验来确认，才能报告阳性。这里抗HCV和抗HIV的检测均使用病毒部分的基因工程抗原，其他一些病毒如流感病毒、腮腺炎病毒和水痘病毒等感染人体后，亦或一些自身抗体，也有可能会导致假阳性反应。

    HBsAg的测定主要是弱阳性的问题，这与ELISA测定的“灰区”有关系，处于cut-off值周围亦即“灰区”的结果的可靠性通常较差，阳性当然需要确认，阴性却也未必是真，这一点在血站筛检献血员血液时是非常重要的，必须引起注意，并采取适当的措施，防止此类严重影响人们健康的传染性疾病经输血传播，本书后面的有关章还会对此问题做详细论述。此外，免疫测定的基础是抗原抗体的特异反应，因此，如检测抗原，除了要求抗体(单抗或多抗)是特异的外，还要求待测抗原上必须存在有能与所用抗体结合的抗原决定簇，如果因为基因突变导致某些位点的不表达，或者结合位点因为某些原因被封闭或阻断，都会影响抗体与抗原的结合，造成假阴性结果。

    如检测抗体，则要求所用包被抗原应尽可能包含所有的特异抗原决定簇，同时又尽可能不含有非特异的成分，这一点往往由于技术水平的而难以完全做到，因此，从某种意义上来说，假阳性假阴性是不能完全避免的，尽管通过努力，可以将其降至很低的程度。这也是建立临床免疫检验方法所努力的方向. 

    可用作ELISA测定的标本十分广泛，体液（如血清）、分泌物（唾液）和排泄物（如尿液、粪便）等均可作标本以测定其中某种抗体或抗原成份。有些标本可直接进行测定（如血清、尿液），有些则需经预处理（如粪便和某些分泌物）。大部分ELISA检测均以血清为标本。血浆中除尚含有纤维蛋白原和抗凝剂外，其他成份均同等于血清。制备血浆标本需借助于抗凝剂，而血清标本只要待血清自然凝固、血块收缩后即可取得。除特殊情况外，在医学检验中均以血清作为检测标本。在ELISA中血浆和血清可同等应用。血清标本可按常规方法采集，应注意避免溶血，红细胞溶解时会释放出具有过氧化物酶活性的物质，以HRP为标记的ELISA测定中，溶血标本可能会增加非特异性显色。 

    血清标本宜在新鲜时检测。如有细菌污染，菌体中可能含有内源性HRP，也会产生假阳性反应。如在冰箱中保存过久，其中的可发生聚合，在间接法ELISA中可使本底加深。一般说来，在5天内测定的血清标本可放置于4℃，超过一周测定的需低温冰存。冻结血清融解后，蛋白质局部浓缩，分布不均，应充分混匀宜轻缓，避免气泡，可上下颠倒混和，不要在混匀器上强烈振荡。混浊或有沉淀的血清标本应先离心或过滤，澄清后再检测。反复冻融会使抗体效价跌落，所以测抗体的血清标本如需保存作多次检测，宜少量分装冰存。保存血清自采集时就应注意无菌操作，也可加入适当防腐剂。 

    2 试剂的准备 

    按试剂盒说明书的要求准备实验中需用的试剂。ELISA中用的蒸馏水或去离子水，包括用于洗涤的，应为新鲜的和高质量的。自配的缓冲液应用pH计测量较正。从冰箱中取出的试验用试剂应待温度与室温平衡后使用。试剂盒中本次试验不需用的部分应及时放回冰箱保存。 

    3 加样 

    在ELISA中一般有3次加样步聚，即加标本，加酶结合物，加底物。加样时应将所加物加在LEISA板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可溅出，不可产生气泡。 

加标本一般用微量加样器，按规定的量加入板孔中。每次加标本应更换吸嘴，以免发生交叉污染，也可用一次性的定量塑料管加样。有此测定（如间接法ELISA）需用稀释的血清，可在试管中按规定的稀释度稀释后再加样。也可在板孔中加入稀释液，再在其中加入血清标本，然后在微型震荡器上震荡1分钟以保证混和。加酶结合物应用液和底物应用液时可用定量多道加液器，使加液过程迅速完成。 

    4 保温 

    在ELISA中一般有两次抗原抗体反应，即加标本和加酶结合物后。抗原抗体反应的完成需要有一定的温度和时间，这一保温过程称为温育(incubation)，有人称之为孵育，在ELISA中似不恰当。 

    ELISA属固相免疫测定，抗原、抗体的结合只在固相表面上发生。以抗体包被的夹心法为例，加入板孔中的标本，其中的抗原并不是都有均等的和固相抗结合的机会，只有最贴近孔壁的一层溶液中的抗原直接与抗体接触。这是一个逐步平衡的过程，因此需经扩散才能达到反应的终点。在其后加入的酶标记抗体与固相抗原的结合也同样如此。这就是为什么ELISA反应总是需要一定时间的温育。 

    温育常采用的温度有43℃、37℃、室温和4℃（冰箱温度）等。37℃是实验室中常用的保温温度，也是大多数抗原抗体结合的合适温度。在建立ELISA方法作反应动力学研究时，实验表明，两次抗原抗体反应一般在37℃经1-2小时，产物的生成可达顶峰。为加速反应，可提高反应的温度，有些试验在43℃进行，但不宜采用更高的温度。抗原抗体反应4℃更为彻底，在放射免疫测定中多使反应在冰箱中过夜，以形成最多的沉淀。但因所需时间太长，在ELISA中一般不予采用。

    保温的方式除有的ELISA仪器附有特制的电热块外，一般均采用水浴，可将ELISA板置于水浴箱中，ELISA板底应贴着水面，使温度迅速平衡。为避免蒸发，板上应加盖，也可用塑料贴封纸或保鲜膜覆盖板孔，此时可让反应板漂浮在水面上。若用保温箱，ELISA板应放在湿盒内，湿盒要选用传热性良好的材料如金属等，在盒底垫湿的纱布，最后将ELISA板放在湿纱布上。湿盒应先放在保温箱中预温至规定的温度，特别是在气温较低的时候更应如此。无论是水浴还是湿盒温育，反应板均不宜叠放，以保证各板的温度都能迅速平衡。室温温育的反应，操作时的室温应严格在规定的范围内，标准室温温度是指20-25℃，但具体操作时可根据说明书的要求控制温育。室温温育时，ELISA板只要平置于操作台上即可。应注意温育的温度和时间应按规定力求准确。为保证这一点，一个人操作时，一次不宜多于两块板同时测定。 

    5 洗涤 

    洗涤在ELISA过程中虽不是一个反应步骤，但却也决定着实验的成败。ELSIA就是靠洗涤来达到分离游离的和结合的酶标记物的目的。通过洗涤以清除残留在板孔中没能与固相抗原或抗体结合的物质，以及在反应过程中非特异性地吸附于固相载体的干扰物质。聚苯乙烯等塑料对蛋白质的吸附是普遍性的，而在洗涤时又应把这种非特异性吸附的干扰物质洗涤下来。可以说在ELISA操作中，洗涤是最主要的关键技术，应引起操作者的高度重视，操作者应严格按要求洗涤，不得马虎。 

    洗涤的方式除某些ELISA仪器配有特殊的自动洗涤仪外，手工操作有浸泡式和流水冲洗式两种，过程如下： 

    （1）浸泡式 a.吸干或甩干孔内反应液；b.用洗涤液过洗一遍（将洗涤液注满板孔后，即甩去）；c.浸泡，即将洗涤液注满板孔，放置1-2分钟，间歇摇动，浸泡时间不可随意缩短；d.吸干孔内液体。吸干应彻底，可用水泵或真空泵抽吸，也可甩去液体后在清洁毛巾或吸水纸上拍干；e.重复操作c和d，洗涤3-4次（或按说明规定）。在间接法中如本底较高，可增加洗涤次数或延长浸泡时间。 

微量滴定板多采用浸泡式洗涤法。洗涤液多为含非离子型洗涤剂的中性缓冲液。聚苯乙烯载体与蛋白质的结合是疏水性的，非离子型洗涤剂既含疏水基团，也含亲水基团，其疏水基团与蛋白质的疏水基团借疏水键结合，从而削弱蛋白质与固相载体的结合，并借助于亲水基团和水分子的结合作用，使蛋白质回复到水溶液状态，从而脱离固相载体。洗涤液中的非离子型洗涤剂一般是吐温20，其浓度可在0.05%-0.2%之间，高于0.2%时，可使包被在固相上的抗原或抗体解吸附而减低试验的灵敏度。 

    （2）流水冲洗式 流水冲洗法最初用于小珠载体的洗涤，洗涤液仅为蒸馏水甚至可用自来水。洗涤时附接一特殊装置，使小珠在流水冲击下不断地滚动淋洗，持续冲洗2分钟后，吸干液体，再用蒸馏水浸泡2分钟，吸干即可。浸泡式犹如盆浴，流水冲洗式则好比淋浴，其洗涤效果更为彻底，且也简便、快速。已有实验表明，流水冲洗式同样也适用于微量滴定板的洗涤。洗涤时设法加大水流量或加大水压，让水流冲击板孔表面，洗涤效果更佳. 

下面就HBcAb和HBeAb ELISA测定具体操作步骤分述如下。

    1．HBcAb的竞争法测定

    (1)先将HBcAg在碳酸盐缓冲液中4~C过夜包被，形成固相抗原，洗涤去除未与固相结合或结合不紧的抗体后，用小牛血清或牛血清白蛋白等封闭，洗涤去除未结合的部分及杂质。

    (2)同时加入待测样本和酶标的特异抗体，温育一定时间后洗板；此步中，待测样本的抗体将与酶标抗体竞争与固相上特异抗原结合。

    (3)加入酶底物，温育显色测定，显色的强弱与待测样本中的相应抗体的含量成反比

2.HBeAb的竞争法测定

    (1)先将HBeAb在碳酸盐缓冲液中4℃过夜包被，形成固相抗体，洗涤去除未与固相结合或结合不紧的抗原后，用小牛血清或牛血清白蛋白等封闭，洗涤去除未结合的部分及杂质； 

    (2)同时加入待测样本和中和抗原HBeAg，温育一定时间后洗板；此步中，待测样本的抗体将与固相抗体竞争结合与中和抗原HBeAg，待测样本中HBeAb浓度越高，则与固相HBe—Ab结合的HBeAg越少，反之亦然；

    (3)加入酶标的特异抗体，温育一定时间后洗板；此步中，酶标抗体将与结合于固相抗体上的特异抗原结合；

    (4)加入酶底物，温育显色测定，显色的强弱与待测样本中的相应抗体的含量成反比

HBeAb之所以要采用此种模式测定，主要是HBeAg的不稳定所致，如在固相直接包被HBeAg，则会因为HBeAg向HBcAg的易转变性，而导致测定误差。

    抗体的竞争法测定不同于只有单个抗原决定簇的小分子抗原的竞争法测定，其测定的可靠性，在很大程度上受竞争抗体的特异性和亲和力大小的影响，竞争抗体与待测抗体在结合的特异性及亲和力越接近一致，则测定的可靠性越强，但竞争用抗体均为相应抗原免疫动物所得，与机体感染病毒后所产生的抗体肯定会有所差异，因而，在目前HBeAb和HBcAb的临床检测中，常有难以解释的测定结果出现，这与其在方法学上的固有缺陷是分不开的。

 大分子抗原因其具有两个以上的抗原决定簇，而可用双抗体夹心法测定，小分子半抗原如地高辛、茶碱等药物以及T3，T4及睾酮等激素因其只有一个抗原决定簇，从而无法使用双抗夹心方法测定，只能采用竞争抑制法测定。

  具体步骤如下：

    1．先用抗小分子的特异抗体如双抗体夹心法一样包被固相并封闭;

    2．同时加入待测样本和酶标的小分子，温育一定时间后洗板；此步中，待测样本的小分子将与酶标小分子竞争与固相上特异抗体结合;

    3．加入酶底物，温育显色测定，显色的强弱与待测样本中的小分子含量成反比.

这种测定模式中，需要得到小分子与酶的结合物，而小分子酶结合物一则在制备上不如抗体酶结合物简便，二则其纯化亦颇为困难，结合有小分子的酶与游离酶之间难于分离。因此，有人尝试在合成二或多聚体小分子的基础上，建立双抗夹心竞争ELISA方法测定小分子，测定的灵敏度和特异性均有所提高.

    1．将病原体的抗原在碳酸盐缓冲液中4~C过夜包被，形成固相抗原，洗涤去除未与固相结合或结合不紧的抗原后，用小牛血清或牛血清白蛋白等封闭，洗涤去除未结合的部分及杂质;   

    2．加入含待测抗体的临床样本如血清等，温育一定时间后洗板；此时，待测抗体就会与固阳上特异抗原反应而吸附于固相上;

    3．加入酶标记的抗人IgG抗体，温育一定时间后洗板；此时，在固相上即形成固相抗原—待测抗体—酶标二抗复合物;

    4．加入酶底物，温育显色测定.

  间接法测抗体在目前应用最多的是丙型肝炎病毒抗体(抗HCV)、人免疫缺陷病毒抗体(抗HIV)以及梅毒螺旋体抗体等的测定。从上述的测定模式可见，间接法测抗体，严格地讲，所测定的仅为抗体的IgG类，不涉及IgM和IgA类，这是由酶标二抗体所决定的。

  影响间接法测定抗体的一个较大的因素是包被抗原的纯度。现在间接法测抗体中所使用的抗原一般均为基因工程重组抗原，如HCV的NS3，NS4，NS5，HIV的gp41和gpl20和梅毒螺旋体TpNl5，TpNl7，TpN47等。基因工程抗原在纯化时应尽量去除用来表达的宿主如大肠杆菌的抗原，以免由于机体存在对这种宿主抗原的抗体而引起假阳性反应。此外，由于机体的IgG类抗体浓度较高，其中绝大部分为机体接触外界环境刺激所产生的非特异IgG，因此，为避免这些高浓度非特异IgG对固相的吸附所致的假阳性反应，通常需对待测样本做一定程度的稀释.

    1．首先以双抗体之一于碳酸盐缓冲液中4℃下过夜包被聚苯乙烯等固相，形成固相抗体，洗涤去除未与固相结合或结合不紧的抗体后，用小牛血清或牛血清白蛋白等封闭，洗涤去除未结合的部分及杂质;

    2．加入含待测物的临床样本如血清等，温育一定时间后洗板；此时，待测抗原就会与固相上特异抗体反应而吸附于固相上;

    3．加入酶标记的双抗体之二，温育一定时间后洗板；此时，在固相上即形成双抗体与特异抗原的夹心产物;

    4．加入酶底物，温育显色测定. 

    在该测定模式中，有两步温育和板孔洗涤步骤，如果将上述测定步骤2和3并为一步，即将待测样本和酶标抗体同时加入，从而仅有一步温育和洗板过程，即为通常所说的“一步法”。最初的双抗夹心ELISA试剂盒，均采用两步法。后来，人们为了节省时间，简化操作步骤，试剂生产厂家逐步推出了“一步法”试剂盒。目前在我们的临床实验室中，测定大分子抗原如HBsAg、。FP和hCG等，基本上都采用一步法。一步法相比于两步法，虽然操作简单‘但有其固有的缺陷，处理不好，对ELISA测定结果有严重影响。

    在通常的两步温育洗涤方法中，抗原抗体反应将遵循下述规律，即在第一步中加入的待测标本中抗原(Ag)浓度逐步增加时，将使固相抗体(Ab)与抗原的结合逐步达到饱和[(1)式]，这样当随后加入一定浓度的酶标抗体(Ab’)后，a复合物的形成将直接与在第一步中形成的b复合物相关[(2)式]，因此，待测抗原浓度的逐步增加导致了显色的逐步加深，当抗原浓度增加到一定程度时，反应显色达到平台，而呈S形变化曲线. 

    而一步法双抗夹心ELISA的反应曲线则为钟形曲线。也就是说测定显色随着待则标本中抗原浓度的增加而升高至一定程度后，测定吸光度即随抗原浓度的增加而开始下降直至不显色，即所谓的“钩状效应”(hook eHect)，也就是我们在免疫沉淀试验中所称的“带现象”(zonephen。menon)。一步法的反应平衡式如(3)式

    此外，b和c复合物的增加亦使得“双抗体夹心复合物”难以形成。但如果  固相单抗和标记单抗采用针对抗原的不同且空间距离较远的决定簇的抗体，即包被使用一种  单抗，酶标记使用另一种单抗，同时充分混匀反应液，并适当延长反应温育时间，则可使b。和  d复合物减少至最低程度，而大大减轻“钩状效应”。

    我们曾使用本室能得到的含最高浓度(约2mg／m1)HBsAg的血清样本对目前国内较大的试剂生产厂家的“一步法”HBsAg测定ELISA试剂盒的“钩状效应”进行了评价，尽管大部分有在HBsAg最高浓度下的测定显色较次高浓度(1：lo稀释)显色要浅的现象，但均未出现该份样本测定为阴性的情况。尽管如此，在临床实际工作中，仍有可能遇到“钩状效应”较严重的HBsAg测定ELISA试剂盒，我们也经常听到基层实验室同行在这方面的反映。因此，大家还应该重视这方面的问题·，当发现测定结果明显与临床不符或与相关测定指标互有矛盾，如 HBeAg阳性样本HBsAg测定为阴性时，就应考虑HBsAg测定可能存在的“钩状效应”问题。

    综上所述，一步法ELISA试剂盒作为迎合临床实验室简便快速要求的产物，有着巨大的市场，其虽有潜在缺陷，易导致含高浓度待测物的标本检测为阴性(假阴性)，但精心的实验设计，对包被和酶标记抗体仔细选择，完全可以将“钩状效应”出现的可能性降至最低。此外，建议生产HBsAg，aFP和hCGELISA"一步法”测定试剂盒的厂家，应对所产的试剂在出厂前对其“钩状效应"(hookeffect)进行充分的研究，并提醒用户在使用时应注意之处。

    双抗体夹心法测抗原另一个所需要注意的是类风湿因子(RF)的干扰。我们知道，RF是一种抗变性IgG的自身抗体，主要为19S的IgM类抗体，也可见7S的IgG及IgA类抗体。这种自身抗体的特性是其是能与多种动物的变性IgG的Fc部分结合。因此，如果血清标本中含有RF，在双抗夹心ELISA检测时，其即可作为固相抗体和酶标抗体(均为IgG)之间的桥接抗原，而产生假阳性反应。因此，如果使用抗体的Fab2：或Fab片段作为酶标记用抗体，则可避免RF的干扰.