答：（一）影响微生物需氧的因素：不同的微生物对于氧的需求不同，供氧不足，会抑制好氧微生物的生长代谢。而兼性微生物如酵母、乳酸菌在无氧情况下，也能通过酵解获得能量。对绝对厌氧微生物来说氧则是一种毒害。

（1）微生物的耗氧速度常用单位质量的细胞(干重)在单位时间内消耗氧的量，即比耗氧速率(或呼吸强度)来表示。各种微生物的呼吸强度是不同的，并且呼吸强度是随着培养液中溶解氧浓度的增加而加强。

（2）细胞浓度直接影响培养液的摄氧率，随着细胞浓度的迅速增加，摄氧率也迅速增高，在对数生长期的后期达到峰值。

（3）培养基的成分和浓度显著地影响微生物的摄氧率，在发酵过程中若进行补料或加糖，可使微生物的摄氧率为之增加。

（4）微生物呼吸强度的临界值还与一些培养条件如pH值、温度等有关。在一定范围内，温度越高，营养成分越多，临界值也相应增高。

（5）有毒物质的形成和积累如NH3、CO2等，如不能及时从培养液中排出，也会抑制微生物的呼吸。此外，挥发性中间物如糖代谢中挥发性有机酸，因大量通气而引起损失，会影响微生物的呼吸。

（二）摇瓶发酵供氧水平的调节：调节KLa（供氧系数）是最常用的方法，KLa反映了设备的供氧能力，一般来讲大罐比小罐要好。

影响摇瓶KLa的因素：装液量和摇瓶机的种类装液量，一般取1/10左右，因此可以调节两者比例调节摇瓶发酵的供氧水平。

（三）通气搅拌发酵罐供氧水平的调节。在通气发酵罐中，全挡板条件下：

（1）理论上：提高搅拌，调节KLa的效果显著

（2）实际上：对于转速的调节有时是有限度的。通风的增加也是有限的，蒸发量大，中间挥发性代谢产物带走。

（3）小型发酵罐和大型发酵罐调节KLa的特点：小型发酵罐，转速可调；大型发酵罐，转速往往不可调。

因此调节通气搅拌发酵罐的供氧水平可以通过：

（1）改变搅拌速度  搅拌器可以从多方面改善通气效率，对物质传递的作用包括：可将通入培养液的空气打散成细小的气泡，防止小气泡的凝集，从而增大气液相的有效接触面积；使液体形成涡流，延长气泡在液体中的停留时间；增加液体的湍动程度，减少气泡外滞流液膜的厚度，从而减小传递过程的阻力；使培养液中的成分均匀分布。对于没有搅拌器的通气发酵罐，则是利用空气带动液体运动，产生搅拌作用。

（2）改变通气速率  在通气培养中，空气为微生物提供氧气外，还能带走发酵废气。实际上通气量的影响是有一定限度的，如果超过这一限度．搅拌器就不能有效地将空气泡分散到液体中，而在大量空气泡中空转，发生“过载”现象。此时叶轮不能分散空气．气流形成大的气泡，沿轴的周围逸出。当气流流量超过过载速度后，这时搅拌功率会大大下降，KLa也不能再提高。

（3）改变培养液的理化性质  在发酵过程中、微生物自身的生长繁殖和代谢可引起发酵液的性质，如密度、黏度、表面张力、扩散系数等的不断变化．这些性质的变化都会影响氧的传递效率值。

（4）改变气体组分中的氧分压  用通入纯氧的方法来改变空气中氧的含量。

（5）加入氧载体  氧载体一般是不溶于发酵液的液体，呈乳化状态来提高汽液相之间的传递，也就是说在汽液间起到氧传递的促进作用。常用的氧载体有：①血红蛋白；②烃类碳氢化合物（煤油、石蜡、甲苯与水等）；③含氟碳化物。

（6）改变罐压  

2、准确判断发酵终点有什么好处？依据哪些参数来判断？ 

答：（一）准确判断发酵终点好处：微生物工程的基本任务是高效地利用微生物的内生产能力，以较低能耗和物耗最大限度的生产生物产品，因此在实际生产过程中，通过对发酵过程的控制，准确的判定发酵的终点，对生产进行定性和定量的描述，以期达到对发酵过程进行优化，到达有效的生产。

（二）判断发酵终点的参数：产物浓度、菌丝形态、过滤速度、氨基氮含量、残糖含量、PH、DO、发酵液的粘度和外观等。

3、染菌对发酵有什么危害，对提炼有什么危害？有哪些原因会引起染菌？染菌以后应采取什么措施？ 

答：（一）染菌对发酵的危害：

发酵过程污染杂菌，会严重影响生产，对发酵工业是致命的：

（1）造成大量原材料的浪费，在经济上造成巨大损失

（2）扰乱生产秩序，破坏生产计划。

（3）遇到连续染菌，特别在找不到染菌原因往往会影响人们的情绪和生产积极性。

（4）影响产品外观及内在质量

（二）染菌对提炼的影响：

(1)染菌对过滤的影响

粘度大，过滤困难，拉长过滤时间，影响设备周转，降低过滤收率。

影响程度：杂菌种类，污染程度

措施：加热、冷却、添加助滤剂等

 (2)发酵染菌对提炼的影响

染菌发酵液中含有比正常发酵液更多的水溶性蛋白和其它杂质。

采用有机溶剂萃取的提炼工艺，则极易发生乳化，很难使水相和溶剂相分离，影响进一步提纯。采用直接用离子交换树脂的提取工艺，如链霉素、庆大霉素，染菌后大量杂菌黏附在离子交换树脂表面，或被离子交换树脂吸附，大大降低离子交换树脂的交换容量，而且有的杂菌很难用水冲洗干净，洗脱时与产物一起进入洗脱液，影响进一步提纯。

（三）引起染菌的原因：

(1)设备渗漏  设备渗漏包括夹套穿孔、盘管穿孔、接种管穿孔、阀门渗漏、搅拌轴渗漏、罐盖漏和其它设备漏等。

(2)空气带菌  因为空气除菌系统较为复杂，环节多，偶遇不慎便会导致空气除菌失败。

(3)种子带菌  种子带菌又分为种子本身带菌和种子培养过程中染菌。加强种子管理，严格无菌操作，种子本身带菌是可以克服的。种子培养过程染菌与发酵一样有许多因素造成。

(4)灭菌不彻底  灭菌技术的好坏与灭菌质量很有关系

蒸汽通入培养基，升温快慢、保温时间——产生过多泡沫

蒸汽总压是否达到要求标准

环境中的杂菌数量因季节而有很大差别。

原材料储存和保管，如液胨、玉米浆、母液糖等有机原料——杂菌的数量

发酵罐、培养基配制罐等设备的清洗质量——有无灭菌的死角

(5)技术管理不善  技术管理就是要对发酵每个环节严格控制

染菌后的培养基必须灭菌后才可放下水道。灭菌方法：可通蒸汽灭菌，也可加入过氧乙酸等化学灭菌剂搅拌半小时，才放下水道。否则由于各罐的管道相通，会造成其它罐的染菌，而且直接放下水道也会造成空气的污染而导致其它罐批染菌。

凡染菌的罐要找染菌的原因，对症下药，该罐也要彻底清洗，进行空罐消毒，才可进罐。

染菌厉害时，车间环境要用石灰消毒，空气用甲醛熏蒸。特别，若染噬菌体，空气必须用甲醛蒸汽消毒。

（四）发酵染菌后的措施：

（1）染菌后的培养基必须灭菌后才可放下水道

（2）凡染菌的罐要找染菌的原因，对症下药，该罐也要彻底清洗，进行空罐消毒，才可进罐。

染菌厉害时，车间环境要用石灰消毒，空气用甲醛熏蒸。特别，若染噬菌体，空气必须用甲醛蒸汽消毒。

4、试回答什么是生物反应过程中的直接参数和间接参数，并各举5个实例。

答：直接参数：通过仪器或其它分析手段可以测得的参数，如温度、pH、残糖、搅拌速度、黏度、菌体浓度、空气压力等。

间接参数：直接参数经过计算得到的参数，如摄氧率、酶活力、生长速率、基质消耗速率、呼吸熵、呼吸强度等。

5、什么是间歇培养？间歇培养时细胞生长过程中包括哪几个阶段？

答：间歇培养又称分批培养，是在一定体积的液体培养基中接种少量微生物并保持一定的条件（如温度，PH，溶解氧等）进行培养，结果会出现微生物数量由少到多，并达到高峰，又由多变少的变化规律。

间歇培养时细胞生长过程中包括：滞后期、对数生长期、平稳期，衰亡期。

（1）延滞期

 现象：活菌数没增加，曲线平行于横轴。

特点：生长速率常数= 0；细胞形态变大（长）；细胞内RNA特别是rRNA含量增高；合成代谢活跃，易产生诱导酶；对外界不良条件敏感。

原因： 适应新的环境条件，合成新的酶，积累必要的中间产物；影响延迟期长短的因素：菌种；接种物菌龄(对数生长期)；接种量(大，易形成优势)；培养基成分(合成与天然培养基)

（2）对数期

 现象：细胞数目以几何级数增加，其对数与时间呈直线关系。

特点：生长速率常数最大;平衡生长;代谢最旺盛;对理化因素较敏感;

影响因素：菌种;营养成分与浓度;培养温度;

（3）稳定期

特点：①细胞增殖与死亡数几乎相等，细胞数达最高值；②开始积累内含物或产芽孢；③开始合成次生代谢产物；

影响因素：性营养物的量；营养物的比例；有害代谢废物的积累；物化条件；

（4）衰亡期

 特点：①出现“负生长”；②细胞出现多形态变化；③菌体死亡、自溶；

影响因素：环境条件变化；分解代谢超过合成代谢；

6、泡沫的控制方法可分哪两大类？请简述之。

答：控制泡沫的方法主要包括机械消沫和消沫剂消沫两大类。

（一）机械消沫是利用物理作用，靠机械的强烈振动或压力的变化促使泡沫破碎。

机械消沫的方法有多种，一种是在罐内将泡沫消除，最简单的是在搅拌轴的上部安装消沫桨，当消沫桨随着搅拌轴转动时，将泡沫打碎。另一种是将泡沫引出罐外．通过喷嘴的加速作用或利用离心力消除泡沫后，液体再返回罐内。 机械消沫的优点是不需要引人外来物质，可节省原材料，减少杂菌污染的机会，也可以减少培养液性质的变化，对提取工艺无任何副作用。其缺点是效率不高，对黏度较大的流态型泡沫几乎没有作用，也不能消除引起泡沫稳定的根本原因，所以仅作为消沫的辅助方法。

（二）消沫剂消沫：因为形成泡沫的因素很多．所以选择消沫剂的作用机制也是多样的，消沫剂一般是采用表面活性物质。当泡沫的表面存在有极性表面活性物质形成的双电层时，另一种极性相反的表面活性物质的加人，可以中和电性，破坏泡沫的稳定性，使泡沫破碎。或者加入更强极性的物质与发泡剂争夺泡沫表面上的空间，而引起力的不平衡，并使液膜的机械强度降低，促使泡沫破碎。当泡沫的液膜具有较大的黏度时，可加入某些分了内聚力小的物质，以降低液膜的表面黏度，使液膜的液体流失，导致泡沫破碎。

7、获得所培养细胞的生物量，可采用什么方法进行测定，试举2～3例？

答：测定所培养细胞的生物量常采用一些在线连续菌量测定方法，如浊度法、荧光测量法、电容测定法、排气分析法。

（1）浊度法：常用的流通式浊度计的原理，是使发酵罐中的发酵液进入一流通式薄层色杯，用波长500-600nm的光束测量发酵液的光密度，然后发酵液再返回发酵罐中，所测度的吸光值与细胞浓度成线性关系。流通式浊度汁适用于无团体颗粒培养基的单细胞微生物(如细菌)浓度的测定。

（2）荧光测量法：测量装置是采用一个低压水银蒸气灯作为光源，经一滤波片保证最佳的激光光波长通过，用光导纤维将此光束引入发酵罐．此处用一光学装置以确保最佳的辐射条件；产生的荧光再被光导纤维捕获，通过滤光片进人检测器，得到相应的最大峰值。测最后量信号被处理后所显示的毫伏数，可表示菌量浓度的相对值。这种方法的灵敏度比一般比色法高得多，并具有较好的选择性。

8、发酵操作方式可分为分批、流加和连续三种，试述三种方法的优缺点。

答：（一）分批发酵

优点：操作简单，周期短，染菌的机会减少和生产过程，产品质量易掌握；

缺点：分批发酵不适用于测定其过程动力学，因使用复合培养基，不能简单地运用Monod方程将来描述生长、存在基质抑制问题，出现二次生长现象。如对基质浓度敏感的产物，或次级代谢物，抗生素，用分批发酵不合适，因其周期较短、—般在1—2天，产率较低。达主要是由于养分的耗竭，无法维持下去。

（二）流加发酵

优点：它能在这样一种系统中维持很低的基质浓度，从而避免快速利用碳源的阻遏效应和能够按设备的通气能力去维持适当的发酵条件，并且能减缓代谢有害物的不利影响。可以通过补料控制达到最佳的生长和产物合成条件；还可以利用计算机控制合理的补料速率，稳定最佳生产工艺。

缺点：由于没有物料取出，产物的积累最终导致比生产速率的下降。由于有物料的加入增加了染菌机会

（三）连续发酵

优点：在连续发酵达到稳态后，其非生产占用的时间要少许多，故其设备利用率高，操作简单，产品质量较稳定．对发酵设备以外的外围设备(如蒸汽锅炉，泵)的利用率高，可以及时排除在发酵过程中产生的对发酵过程有害的物质。

①可以提高设备的利用率和单位时间产量，只保持—个期的稳定状态。

②发酵中各参数趋于恒值，便于自动控制。

③易于分期控制。可以在不同的罐中控制不同的条件。

缺点：

①污染杂菌问题  在连续发酵过程中需长时间不断地向发酵系统供给无菌的新鲜空气和培养基，这就增加染菌的可能性。尽管可以通过选取耐高温、耐极端pH和能够同化特殊的营养物质的菌株作为生产菌种来控制杂菌的生长。们这种方法的应用范围有限。故染菌问题仍然是连续发酵技术中不易解决的课题。

②生产菌种突变问题  微生物细胞的遗传物质DNA在复制过程中出现差措的频率为百万分之一。尽管自然突变频率很低，—旦在连续培养系统中的生产菌中出现某一个细胞的突变，且突变的结果使这一细胞获得高速生长能力．但失去生产能力的话，最终取代系统中原来的生产菌株．而使连续发酵过程失败。而且，连续培养的时间愈长，所形成的突变株数愈多，发酵过程失败的可能性便愈大。

9、生物反应器的放大方法有哪些？

答：（1）经验放大法；它是依靠对已有装置的操作经验所建立起来的以认识为主而进行的放大方法，这些认识多半是定性的，仅有一些简单的、粗糙的定量概念。由于该法对事物的机理缺少透彻的F解，因而放大比例一般较小。并且此法不够精确。但是对于目前还难于进行理论解析的领域，还要依靠经验放大法。对生物反府器，到目前为止应用较多的方法也是根据经验和实用的原则进行反应器的放大与设计。

（2）因次分析法；因次分析法系依据相似原理，以保持无因次准数相等的原则进行放大，该法又称为相似模拟法。此法是根据对过程的了解，确定影响该过程的控制因素；用因次分析方法求得相似准数。

（3）时间常数法：是指某一变量与其变化速率之比；常用的时间常数有：混合时间，反应时间，扩散时间，液体停留时间，气体停留时间，传质时间，等等。

（4）数学模拟法：所谓数学模拟法，简言之，就是根据有关的原理和必要的实验结果，对一实际对象用数学方程的形式加以描述，然后再用计算机进行模拟研究、设计和放大。

10、机械搅拌发酵罐中，搅拌器的搅拌作用是什么？搅拌转速的高低对不同种类微生物的生长、代谢有何影响？

答：（一）搅拌的作用

①液体通风后进入的气泡在搅拌中随着液体旋转使之所走路程延长，使发酵液中保持的空气数量增加，实际上是增加了传质量。②通过搅拌，大气泡被搅拌器打碎，增加比表面积。③搅拌速度越快，搅拌雷诺准数增加，增加了传氧速率。

（二）搅拌转速的高低对不同种类微生物的生长、代谢的影响

高转速会影响某些微生物的菌丝形态，尤其是影响霉菌和放线菌的菌丝形态。使菌丝变成短粗的分枝，也因搅拌的剪切作用造成细胞损伤，使菌丝提早自溶，因此选择发酵罐中搅拌转速时应多次反复试验选择最佳搅拌转速。

1、固定化酶的制备方法？

答：（1）载体结合法：此法是将酶结合在非水溶性的载体上。

经常使用的载体有：纤维素、壳聚糖、琼脂糖等多糖类衍生物和聚丙烯酞胺凝胶等 

根据结合的形式不同，可分为共价结合法、离子结合法及物理吸附法。

①共价键结合法：酶蛋白的侧链基团和非水溶性载体表面的功能基团之间形成共价键而固定的方法。

特点：酶与载体结合牢固，酶不易脱落，但反应条件较激烈，酶易失活，同时，操作手续亦较繁琐。

②离子结合法：通过离子效应，将酶固定到具有离子交换基团的非水溶性载体上的一种方法。

③物理吸附法：将酶蛋白吸附到不溶于水的载体上，从而制成固定化酶的方法。

（2）交联法：利用双功能或多功能试剂在酶分子间或酶与载体间、或酶与惰性蛋白间进行交联反应，以制备固定化酶。

交联酶法 ： 在一定条件下，加入一定量的戊二醛溶液于酶溶液中，生成不溶性固定化酶。

②酶与辅助蛋白交联法 ： 用双功能或多功能试剂使惰性蛋白与酶相交联，从而制备固定化酶。

 ③载体交联法 ： 用多或双功能试剂的一部分功能基团与载体交联，另一部分功能基团与酶蛋白交联而制备固定化酶的方法。

（3）包埋法：将聚合物的单体与酶溶液混合，再借助于聚合促进剂(包括交联剂)的作用进行聚合，酶被包裹在聚合物中以达到固定化。

特点： 包埋法操作简单，由于酶分子只被包埋，未受到化学反应，可以制得较高活力的固定化酶，对大多数酶、粗酶制剂甚至完整的微生物细胞都通用。但是，在发生化学聚合反应时，需要在比较苛刻的条件下进行，从而容易导致酶失活，因此，要设计好包埋条件。

2、分析造成固定化酶反应器产率下降的原因？

答：固定化化酶反应器产率下降的原因主要有：

（1）酶反应器中酶的损失：载体的破碎；载体的溶解；酶从载体上的失落。

（2）酶-底物之间接触不良：通过反应器时的流动形态不规则；固定化酶被其他物质所包裹。

（3）酶活力的损失：中毒；变性；微生物侵袭。

（4）产物的损失：微生物侵袭。

在上述原因中，固定化酶的催化活性的下降或损失是主要因素。

3、微生物作酶源的优点?

答：①微生物生长繁殖快，生活周期短，产量高。单位干重产物的酶比活很高。如细菌在合适条件下只须20~30min便可繁殖一代，而农作物至少要几天或几周才能增重一倍。

②微生物培养方法简单。所用原料大多为农副产品，来源丰富，价格低廉，机械化程度高，经济效益高。如同样生产1kg结晶的蛋白酶，如从牛胰脏中提取需要1万头牛的胰脏，而由微生物生产仅需数百千克的淀粉、麸皮和黄豆粉等副产品，几天便可生产出来。

③微生物菌株种类繁多，酶的品种齐全。不同环境中的微生物有迥然不同的代谢类型，分解不同的基质有着多样性的酶，可以说一切动植物细胞中存在的酶几乎都能从微生物细胞中找到。

④微生物有较强的适应性和应变能力。可以通过适应、诱导、诱变及基因工程等方法培育出新的产酶量高的菌种

4、酶发酵的重要因素

答：（1）碳源  构成菌体成分的重要元素，产生各种代谢产物和细胞内贮藏物质的主要原料，同时又是化能异养型微生物的能量来源。在酶的发酵生产中，除了要从营养的角度考虑碳源的选择以外，还要考虑到碳源对酶生物合成的调节作用。

（2）氮源  不同的细胞对各种氮源的要求各不相同，应根据要求进行选择和配制。一般说来，动物细胞要求有机氮，植物细胞主要要求无机氮，微生物细胞中，异氧型微生物用有机氮，自氧型微生物用无机氮。

主要要考虑酶生物合成的诱导作用以及是否存在分解代谢作用。在选择碳源时，应尽量选用对所需的酶有诱导作用的碳源，而不是使用或少使用有分解代谢物阻遏作用的碳源。 

如用于生产蛋白酶、淀粉酶的发酵培养基，多数以豆饼粉、花生饼粉等为氮源，因为这些高分子有机氮对蛋白酶的形成有一定程度上的诱导作用；而利用绿木霉生产纤维素酶时，应选用无机氮为氮源，因为有机氮会促进菌体的生长繁殖，对酶的合成不利。

（3）无机盐类  ①构成菌体成分；②作为酶活性基的组成部分或维持酶的活性；③调节渗透压、pH值、氧化还原电位等；④作为自养菌的能源。

当盐浓度太高时，对微生物生长有抑制作用，而在较低浓度时却能刺激生长。 

在微生物的发酵生产中，应特别注意有些金属离子是酶的组成成分，如钙离子是淀粉酶的成分之一，也是芽孢形成所必需的。 

(4）生长因素

凡是微生物生长不可缺少的微量有机物质都称为生长因子(又称生长素)，包括氨基酸、嘌呤、嘧啶、维生素等。

与微生物有关的维生素主要是B族维生素，这些维生素是各种酶的活性基的组成部分，没有它们，酶就不能活动。

(5)pH值的调节控制

不同细胞生长繁殖的最适 pH值有所不同。一般情况下，多数细菌、放线菌生长的最适pH为中性至微碱性（pH 6.5～8.0）；而霉菌、酵母则偏好微酸性（pH 4.0～6.0）；植物细胞生长的最适pH为5～6。培养基pH在发酵过程中能被菌体代谢所改变。若阴离子(如醋酸根、磷酸根)被吸收或氮源被利用后产生NH3 ，则pH上升；阳离子(如NH4、K+ )被吸收或有机酸的积累，使pH下降。培养基pH不仅影响微生物的生长和产酶，而且对酶的分泌也有作用。有些细胞可以同时产生多种酶，通过控制培养基的pH值，往往可以改变各种酶之间的产量比例。所以在细胞培养和发酵过程中，必须对培养基的pH值进行适当的控制和调节。pH值的调节可以通过改变培养基的组分或其比例来实现。必要时可使用缓冲溶液，或流加适宜的酸、碱溶液，以调节控制培养基中pH值的变化。

(6)温度的调节控制

细胞发酵产酶的最适温度与最适生长温度有所不同，而且往往低于最适生长温度，这是由于在较低的温度条件下，可提高酶的稳定性，延长细胞产酶时间。 

有些酶的发酵生产，要在不同阶段控制不同的温度条件。在生长繁殖阶段控制在细胞生长最适温度范围内，以利于细胞生长繁殖，而在产酶阶段，则需控制在产酶的最适温度。 

(6)溶解氧的调节控制

微生物对氧的需要不同，是由于依赖获得能量的代谢方面的差异。好气性菌主要是有氧呼吸或氧化代谢，厌气菌为厌气发酵(分子间呼吸)，兼性厌气菌则两者兼而有之。

在培养基中生长和发酵产酶的细胞，一般只能利用溶解在培养基中的氧气——溶解氧。由于氧是难溶于水的气体，培养基中含有的溶解氧并不多，很快就会被细胞利用完。为此，必须在发酵过程中连续不断地供给无菌空气，使培养基中的溶解氧保持在一定水平，以满足细胞生长和产酶的需要。下载本文