荧光共振能量传递（FRET）是指荧光标记基团在激发光刺激下生成特定波长的发射光，当另一屏蔽基团与其距离合适时，原发射光会被屏蔽基团吸收并转化为其他波长的发射光或热能。这种现象在荧光定量PCR中得到广泛应用。
荧光定量PCR使用的荧光化学可分为两种：荧光探针和荧光染料。在PCR扩增过程中，会加入一对引物和一个特异性的荧光探针。探针通常是一段寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。当探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；但在PCR扩增过程中，Taq酶的5’-3’外切酶活性会将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就会有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。
在荧光定量PCR技术中，靶基因的确定和引物及探针的设计遵循一定的原则。选择检测组共有的基因以避免检测的假阴性；选择检测组内的保守序列（突变少）和组间特异的序列（突变多）作为引物和探针的设计位置，片段长度应在70-150bp之间。
引物的长度应为17-25bp，GC含量应在30-80%，退火温度（Tm值）应在58-60℃之间。避免稳定的引物二聚体及发夹结构（自由能大于-3.5kc/m），序列中不能出现连续的G，3’端避免G或C，最后5个碱基内避免两个以上的G或C。
探针的长度应为20-30bp（Taqman）或16-25bp（MGB），GC含量应在30-80%，Tm值应为68-70℃。避免稳定的二聚体及发夹结构（自由能大于-3.5kc/m），5’端不能是G，位置尽量靠近上游引物。选择波长差异较大（多联检测）或Fam（单联检测）的荧光标记。
实时荧光定量PCR具有特异性强、灵敏度高、避免污染、实现定量、高效低耗、操作简便和快速的特点。通过标准品获得标准曲线，结合Ct值进行准确定量。反应时间小于1.5小时。
荧光定量PCR技术在提高检测效率、缩短检测周期、提高通关速度和降低检测成本、提高经济与社会效益方面具有重要实用意义。详情
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