用
电子显微镜
观察
质粒
DNA
一、材料、试剂和仪器
1、电子显微镜.
2、真空喷镀仪.
3、干净
铜网
.
4、
火棉胶
.
5、
铂铱合金
.
6、醋酸铀水溶液.
7、展开储备液(0.1mg/L
细胞色素C
,1mol/L
醋酸铵
).
8、醋酸异戊酯.
9、纯化的质粒DNA样品.
10、
滑石粉
.
二、原理
球状蛋白质
一般都可以在低
盐溶液
或蒸馏水表面形成不溶解的变性薄膜,若浓度合适,则
肽链
伸展形成蛋白质单分子层.一般用碱性蛋白质包围带
负电
的核酸分子,当蛋白质展开时,核酸也随之展开,核酸的形态结构将保持一定的完整性.然后将核酸分子捞到支持膜上,经过
负染色
,就可以在电镜下观察.
三、操作步骤
1、称取3克火棉胶溶解于100ml的醋酸异戊酯中,制成3％的溶液.
2、用
滴管
吸取该液,滴1－2滴于清洁的水面上,当醋酸异戊酯挥发后,在水面上形成一层均匀的火棉胶膜.
3、用镊子小心地将干净的铜网间隔一定距离排列在膜上.
4、在这些铜网上轻轻覆盖一张适当大小的滤纸,待滤纸湿润后将滤纸连同铜网、火棉胶膜轻轻捞起,铜网向上放于一干净
培养皿
中晾干备用.
5、将核酸样品(浓度为5mg/ml-10mg/ml)加到展开溶液中,终浓度为1mg/ml-0.5mg/ml,作为上相液.
6、将重
蒸水
注入干净的培养皿中,作为下相液.
7、将干净的
载玻片
斜放在培养皿中,在水表面撒少量滑石粉,以指示
单分子膜
的展开情况.
8、取50ul左右的上相液,在离下相液表面1cm处轻轻滴到斜面上,使上相液缓缓触及下相液表面并形成一层单分子膜.
9、用镊子夹着铜网,膜面朝下,轻轻沾取下相液表面的核酸分子.用滤纸吸去多余的液体,晾干备用.
10、用醋酸双氧铀染色15分钟,蒸馏水洗3次,每次10分钟,晾干备用.
11、在真空喷镀仪中用铂铱合金投影,以进一步增加电子反差.
12、电镜观察.
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