对1月龄以上大鼠，以10%水合氯醛腹腔注射麻醉后，开胸，经主动脉灌流37℃生理盐水200ml，继以400ml 4%多聚甲醛固定液(用0.1mol/L磷酸缓冲液(PB, pH7.4))灌流固定，取脑、神经垂体入上述固定液中后固定约6h(4℃)后转入30%蔗糖（用0.1 mol/l PB配制，下同）4℃过夜。对出生后1天(P1)、7天(P7)和14天(P14)的新生鼠或幼鼠，直接取脑入固定液固定24h(4℃)后转入30%蔗糖4℃过夜，第2天行恒冷箱冰冻切片(30μm)。按下列步骤对切片进行免疫组织化学反应(ABC法)：
⑴含1% Triton X-100和0.03 %H2O2的0.01 mol/L 磷酸盐缓冲液(PBS, pH7.4)室温30min；
⑵含3%牛血清白蛋白(BSA, Sigma)和1%正常羊血清(NGS, Vector)的0.01 mol/L PBS室温30min；
⑶兔抗HAP1－B多克隆抗体（1：50000，本实验室自制），或羊抗CHAT抗体(1:400,Temecula)，室温孵育过夜。抗体用含3%牛血清白蛋白(BSA，Sigma)和1%NGS的0.01 mol/L PBS稀释(下同)；
⑷0.01 mol/L PBS 漂洗3次，每次10min;
⑸生物素化羊抗兔IgG(1:200, Vector)或生物素化兔抗羊IgG（1：200，中杉金桥）室温2h;
⑹0.01 mol/L PBS 漂洗3次，每次10min;
⑺ABC(1:100, Vector) 室温2h;
⑻0.01 mol/L PBS 漂洗3次，每次10min;
⑼含0.03%DAB和0.006% H2O2的Tris盐酸缓冲液(TB, pH7.6)室温10~15 min。
⑽常规脱水、透明、树脂封片
免疫荧光双标
灌流固定动物、取切片后，按下列步骤对切片进行双标反应：
⑴含1 % Triton X-100和0.03 %H2O2的0.01 mol/LPBS室温30min；
⑵含3% BSA和2%正常驴血清(NDS)的0.01 mol/L PBS室温30min；
⑶羊抗CHAT(1:400)和兔抗HAP1抗体(1:50000) 室温过夜；
⑷0.01 mol/L PBS 漂洗3次，每次10min;
⑸Rodamine Red标记的豚鼠抗兔IgG（1：500）和FITC标记的抗羊IgG（1；200）室温3h(避光)；
⑹0.01 mol/L PBS 漂洗3次，每次10min(避光);
⑺含20%甘油的0.01 mol/L PBS封片。下载本文
