Qubit?4.0荧光计的使用与维护标准操作规程

1.目的

检测核酸建库效果，作为核酸建库的质量控制措施。

2.适用范围

适用于检测核酸和蛋白的含量。

3.职能

用于建库及DNB制备相关的实验员检测核酸或蛋白质。

4.内容

4.1仪器型号

ThermoFishQubit? 4.0Fluorometer

4.2检测原理:

Qubit?4荧光仪定量检测核酸，其原理是基于特定荧光染料与所检测的核酸靶分子结合。这些荧光染料只有与这些靶分子结合时才会发射荧光信号，即使在浓度很低时。Qubit?4.0荧光定量仪比传统的紫外吸光法更加准确。紫外吸光法不具有选择性，测量260nm所有分子的吸光值，包含DNA、RNA、蛋白质、游离核苷酸或多余的盐离子。此外，紫外分光光度计的灵敏度不足，无法完成低浓度DNA和RNA的精确定量。使用Qubit?4荧光定量仪，将大大提升准确性。因为Qubit?4分析试剂盒里的荧光染料只与样品中的特异分子结合——DNA、RNA或蛋白，避免不准确测量带来的重复工作。

4.3检测操作:

4.3.1使用要求：

（1）请勿在阳光直射下操作仪器。

（2）处理样品时戴无粉手套。

（3）仅在室温（22-28 ℃）下使用仪器。

（4）在室温下保存所有的试剂盒，仅在Qubit?4荧光计测定荧光时才插入分析管。

（5）在测量之前请勿用手握住分析管。

（6）测量前仪器已经用适当的校准品校准过。

（7）将样品或标准品与工作液混合之后，让Qubit?DNA和RNA分析管孵育2min。

（8）将样品或标准品与工作液混合之后，让Qubit?蛋白分析管孵育15min。

（9）如果要多次读取同一支管，请从仪器中取出分析管，让其平衡至室温30s，再进行下一次读取。

（10）不建议多次读取RNA样本。

4.3.2配置工作液：

（1）在主界面上选择试剂计算器计算出配置Qubit?工作液所需的染料和缓冲液的量。

（2）输入将在Qubit?4荧光仪上运行的样本数和标准品数量。可选：如果您想在计算的总容量中包含一个额外的管，请按下“超额”复选框。

（3）按Enter计算配置Qubit?工作液所需的Qubit?染料和缓冲液的量。注意：在此屏幕上可以更改计划检测的管数或超额选择。

（4）按Done返回主界面运行Qubit?检测。

4.3.3标准品校准：

（1）从试剂盒里取出标准品standard1,2，在主界面选择要读取新标准的检测类型。要进入可用于检测的第二页，请将屏幕向右滑动。要返回第一页，将屏幕向左滑动。

（2）选择所需的检测方法

（3）点选试验，如果第一次选择会直接提示进行校准，如以前进行过校准，则会提示使用以前的或新进行校准。若要将先前的校正应用于样本读数，请按下“运行样本”。这里选择进行校准。

（4）出现下面界面，将试剂盒中用于校准的标准品1#放入样品室，点击

“Read standard”，大约3秒，读取完成进入到下一步，放入标准品2#，点击“Read standard”（蛋白质校准还需放入标准品3#）。

（5）在读取标准品2#后（或读取标准品3#后），校准就完成了。如果校准成功,软件显示读取标准的屏幕,显示荧光与浓度图。

（6）荧光与浓度图:标准数据点被一条线连接。（圆圈表示正确的标准）如果校准失败，会显示“校准错误”，需重新进行校准。

（7）如果用于RNA IQ检测：检测成功，软件将显示准备好样本信息。如果校准失败,会显示“校准错误”。

（8）如果收到“校准错误”消息，需要重新运行校准。在弹出错误的屏幕中，按“OK”。查看Read标准屏幕。如果希望重新运行标准或运行新的标准，按Read标准，然后重复校准过程。

（9）检测RNA IQ，可以根据校准错误重新运行特定的校准。错误消息提供了如何纠正校准错误的指导。

4.3.4样品检测

（1）将品与反应液混合（混合方案具体见试剂盒）孵化一段时间（DNA和RNA为2min,蛋白质需要15min）。

（2）在Read standard（用于Qubit?定量分析）或Ready for samples界面，按Run samples。

（3）在样本量屏幕中，选择用于Qubit?定量分析或Qubit?RNA IQ 检测的样本体积和单位。在方向盘上按+或-按钮选择检测管中样本体积（1-20ul），从下拉菜单中选择输出样本浓度的单位。在RNA IQ检测中，没有相关的单位，只选样本检测体积。

（4）将样品管插入到样品室，关上盖子，然后点击读取管。定量分析大约需要3秒，质量分析需要5秒。

（5）在屏幕上就会显示所检测的浓度。

（6）多个样品检测：

a. 相同体积和浓度单位：只需更换样本室中样本管，点击读取。

b. 不同体积和浓度单位，更改体积和浓度单位重复上述步骤。

4.3.5数据读取：

（1）如果结果在检测范围内，则显示浓度值。顶部的数值（大体字）是原始浓度。底部的数值为稀释后浓度（插入Qubit?4荧光计的样品管中样品浓度）。检测浓度存在一定范围，如超出检测范围会显示“超出范围”。

（2）可以点击屏幕上左右箭头进入体积和浓度设置界面和荧光与浓度图

a. 空心圆表示进行校准的标准品

b. 大的灰色圆圈代表最新样品

c. 蓝色圆圈代表在检测范围内

d. 黄色圆圈代表在拓展范围内

e. 红色圆圈代表在仪器检测范围外

单个样本多个样本超出检测高限超出检测低限

（3）数据管理

对保存的数据，可以进行以下操作：

a.针对每个样本查看详细的数据:从浓度检测界面、荧光与浓度图界面、主屏幕点击“Data",出现数据屏幕,点击想查看的数据集。

b.重命名数据文件:如需更改数据显示名称，在详细数据界面点击数据名，在弹出的界

面输入想要更改的即可。

c.可以保存数据，导出到USB存储器或电脑中：将USB存储器插入Qubit?4 USB

接口上，如果想导出的是数据集，则勾选该数据集；如需导出的是单个的数据，则点击数据集进入再勾选需要导出的数据；点击导出数据，数据就会以CSV格式保存到USB 存储器。若将数据直接导入到计算机，则使用USB电缆将Qubit?仪器连接到计算机，计算机作为外部设备访问Qubit?荧光剂，使用操作系统的普通文件浏览菜单访问保存在Qubit?仪器上的文件，把需要的文件复制到计算机上。

d.删除数据文件：在浓度、图形、RNA IQ结果或主屏幕上，点击数据。在导出数据

屏幕上，选中要删除数据左侧的选择框。按下删除出现一个警告窗口，按Delete可永久删除选中的数据或数据集。按“取消”可返回到先前的页面，而不删除任何数据。

4.4仪器维护

4.4.1 Qubit?4荧光计不需要定期维护，不要进行任何维修或服务以免损坏仪器。为解决仪器故障，请联系技术支持。

4.4.2不要将Qubit?4荧光计暴露在阳光直射下。

4.4.3 定期清洗：干净的Qubit?4荧光计用湿布擦拭表面。清洁触摸屏，断开电源线，用沾有LCD（液晶显示）清洁剂的软布轻轻擦拭来清洁触摸屏。注：用力过大会损坏触摸屏；立即把屏幕擦干；不要使用研磨性清洁剂或材料避免划伤触摸屏。

4.4.4 消毒仪器：断开荧光计的电源电缆，包括触摸屏，用软布轻蘸 70%乙醇，70%异丙醇或 10%的漂白剂（0.6%次氯酸钠）进行清洁。

注：仪器自带的布不建议与乙醇或异丙醇一起使用；确保清洁液不进入电源按钮、电源入口、样本槽、或USB驱动器端口；切勿将任何液体直接倾倒或喷在仪器上，以免仪器通电时触电。下载本文