一、细菌总DNA提取
二、16SrDNA的扩增
1、以单菌落或菌悬液为模板的16SrDNA扩增体系
25ul体系
Buffer(含有Mg2+)：2.5 ul
dNTP：2.5 ul：
3，-primer：0.5ul
5，-primer：0.5ul
模板：1个单菌落（或1 ul在LB培养液中37℃，12h的菌悬液）
吐温20：2ul
Taq酶：0.3
水：16.7（或15.7ul）
细菌16S rDNA的通用引物为Pf-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG和Rf-TACCTTGTTACCACTT
许敬亮博士论文66页：扩增采用通用的引物，其正向序列为：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'，反向互补序列为： 5'-TTCAGCATTGTTCCAT-3'。
黄婷婷博士论文70页：5’端：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'（Escherichia coli bases 8 to 27），
3’端：5'-TACCTTGTTACGACTT-3'（Escherichia coli bases 1507 to 1492）。
2、以总DNA为模板的16SrDNA扩增体系
25ul体系
Buffer(含有Mg2+)：2.5 ul (购买)
dNTP：2.5 ul：
3，-primer：0.5ul
5，-primer：0.5ul
模板：1 ul
Taq酶：0.3（或0.2ul）
双蒸水：17.7（或17.8ul）
3、PCR反应条件
94℃，5min；95℃，变性30s；50℃～52℃（可根据扩增情况进行适当调节），退火30s；72℃，延伸1min；30个循环；72℃，延伸15min；10℃(or4℃)，保温10min(or nh)。
4、检测扩增效果
取1～3 ul扩增产物,适量load buffer，以DL2000为Marker，上0.75%琼脂糖凝胶跑电泳（电压挑低些80～100，胶长些，利于各扩增产物分离及回收切胶）
注：扩增条件摸索时每个模板只扩1管即可
三、16SrDNA的回收
扩增出的每一管16SrDNA经0.75%琼脂糖凝胶电泳检测后，将效果好的各管16SrDNA合并使达到60～100ul样量，100ul16SrDNA+10ul溴酚蓝跑电泳回收胶(电泳液需换成新鲜的,DL2000为Marker)，EB染色后在紫外灯下切下16SrDNA条带放入1.5ml离心管中(离心管事先称重)，按DNA凝胶回收试剂盒操作说明回收16SrDNA，取回收16SrDNA 2ul(Dl2000为Marker)跑电泳观察浓度(亮度)与纯度(条带数与位置)。
注：回收后的16SrDNA可直接送公司测序
四、16SrDNA与T载体酶连
连接体系
T载体连接液(购买) (含T4DNA连接酶)：5ul
16SrDNA：4ul
H2O：0.7ul
T载体(购买)：0.3ul
上述溶液加入PCR管，在PCR仪中于16℃(or15℃)连接4～12小时
五、16SrDNA转化感受态细胞
1.从-70℃冰箱中取出一管E.ColiDH5α感受态细胞(200ul),于冰盒或冰浴上融化,立即转至冰浴,放置10min。
2.用一冷的无菌吸头把将要转化的DNA片段(10ul)加入到装有200ul感受态细胞的管中,体积不应超过感受态细胞的5%,轻轻旋转几次混匀内容物,冰浴30min(轻轻混匀,使充分接触,可提高转化效率)。
3.将管放入42℃水浴中,放置90s,不要摇动。
4.快速将管转移到冰浴中,使细胞冷却1～2min。
5.每管加800ul LB培养基,用水浴将培养基加温至37℃,然后将管转移至设置为37℃的摇床上,温浴45min,转速应小于225r/min.(常用100rpm)。
6.将适当体积(200ul)已转化的感受态细胞转移到相应抗生素的LB培养基平板上(Amp终浓度为100mg/L,X-gal终浓度为100mg/L)。
7.涂2-3个平板,剩余的已转化感受态细胞放4中保存,不成功可第二天再涂平板。
8.挑取可能含有靶基因DNA插入片段的白色菌落进行培养扩增,提取质粒DNA,利用质粒多克隆位点内的插入外源DNA片段侧翼的酶切位点用相应的性内切酶进行酶切鉴定，也可以直接用菌落PCR进行鉴定。
9.以空载体PUCK18或PUCK19质粒为对照，通过琼脂糖凝胶电泳鉴定克隆DNA片段的大小。
10.取1ml在LB中培养12h的转化细胞送公司测16SrDNA序列。
六、试剂配制
1、50×TAE(L)
242g Tris
57.1ml冰醋酸
100ml 0.5mol/L EDTA-Na2(PH:8.0)
2、0.5mol/L EDTA-Na2(PH:8.0)
186.1g EDTA-Na2,加70ml重蒸水，加7ml，加10 mol/L NaOH,加热搅拌溶解后,再用10mol/L NaOH溶液调PH至8.0,加重蒸水至100ml，高压灭菌备用。
3、引物稀释
配成25uM引物需加ddH2O量为X
5.6nmol×103/ X(ddH2O)=25pmol/ul
X(ul ddH2O)= 5.6×103 pmol /25pmol/ul
注：1OD=5.6nmol下载本文
