文件编码：  SOPXXXX  

1.1.规范蛋白质含量检测（BCA法）的操作过程。

2.范围

2.1.本规程适用于BF02及其它适合于BCA法的样品（原液或成品）的蛋白质含量测定。

3.职责

3.1.方法学研究员负责严格执行本规程规定；

3.2.方法学研究室负责人负责本规程的培训并监督本规程的执行。

4.依据

4.1.《中国药典》2015年版，通则0731“蛋白质含量测定法”，第四法 2,2，-联喹啉-4,4，-二羧酸法（BCA法）

5.定义

5.1.BCA：2,2，-联喹啉-4,4，-二羧酸法

5.2.BSA：牛血清白蛋白

5.3.TCA：三氯乙酸

5.4.EDTA：乙二胺四乙酸

5.5.EGTA：乙二醇-双-(2-氨基乙醚)四乙酸

5.6.DTT：二硫苏糖醇

6.内容

6.1.原理

依据蛋白分子在碱性溶液中将Cu2+还原为Cu+，2,2，-联喹啉-4,4，-二羧酸（BCA）与Cu+结合形成紫色复合物，该复合物在562nm处有最大吸收值。在一定浓度范围内，其溶液颜色深浅与蛋白质浓度呈正比，以蛋白质对照品溶液（BSA）作标准曲线，采用比色法测定供试品中蛋白质的含量。

6.2.实验材料

6.2.1.试药与试液

6.2.1.1.超纯水：电阻率不低于18.2MΩ·cm，本方法所有试液均用超纯水配制。

6.2.1.2.铜-BCA试液：取2, 2'-联喹啉-4，4'-二羧酸钠l.0g，无水碳酸钠2.0g，酒石酸钠0. 16g，氢氧化钠0. 4 g与碳酸氢钠0.95g，加水使溶解成100ml，调节pH值至11.25,作为甲液，甲液室温保存不超过6个月；另取4 % 硫酸铜溶液作为乙液，乙液室温保存不超过6个月，临用前取甲液、乙液，按体积比（甲液：乙液=50:1）进行混匀后使用。

也可购买市售BCA蛋白质定量试剂盒（Pierce BCA Protein Assay Kit），货号：23225，厂家：Thermo，内含Reagent A（即甲液）和Reagent B（即乙液），临用前取Reagent A、Reagent B，按体积比（Reagent A：Reagent B=50:1）进行混匀后使用.

6.2.1.3.BSA标准品溶液：取牛血清白蛋白标准品，按标示含量加水溶解并制成适宜浓度（建议配制为1.0~2.0mg/ml）。分装后于-16℃至-24℃保存，保质期为12个月。

6.2.2.标准物质

BSA（牛血清白蛋白）标准品，来源：购自中国食品药品检定研究院。

6.2.3.仪器与用具

紫外-可见分光光度计、玻璃比色皿、移液器（5.0ml、1000μl、200μl、100μl）、涡旋混合仪、超级恒温水槽、具塞试管、计时器。

6.3.操作步骤

6.3.1.供试品溶液浓度预估

6.3.1.1.原液：若样品无预估浓度，取样品用稀释液适当稀释后进行紫外光谱扫描（扫描波长范围400nm~240nm），确认紫外最大吸收波长（λmax）及该波长下的吸光度值（Aλmax），据此估算待测供试品溶液的蛋白质含量，Aλmax宜控制在0.51.5之间，预估浓度（mg/ml）= Aλmax×稀释倍数。若样品提供方已有预估浓度，可不再进行紫外确认。

6.3.1.2.成品：供试品溶液预估浓度按标示含量稀释后的理论浓度计。无需进行紫外光谱扫描及吸光度确认。

6.3.2.供试品溶液的制备

6.3.2.1.原液：取供试品溶液适量，根据预估浓度，用稀释液将供试品溶液的蛋白质浓度稀释至标准曲线浓度范围内（以0.2～0.3mg/ml为宜），每个供试品做一个平行样。

6.3.2.2.成品：取供试品2瓶，按标示蛋白质含量，用规定体积的溶剂（见各品种项下规定）将供试品复溶，同时用稀释液将复溶后供试品溶液的蛋白质浓度稀释至标准曲线浓度范围内（以0.2～0.3mg/ml为宜）。

6.3.3.标准曲线制作：取牛血清白蛋白标准品溶液，用水稀释至0.5mg/ml。按下表稀释方法制作标准曲线。标准品溶液均直接稀释至具塞试管内。

6.3.5.配制BCA工作液（WR）：计算本次实验所需工作液的用量，取甲液、乙液按体积比（甲液：乙液=50:1）进行混匀，混匀后为绿色溶液。

6.3.6.分别向标准品管及样品管逐管加入5.0ml工作液，立即混匀，置37°C水浴中保温30分钟，取出至室温放置10分钟。

6.3.7.照紫外-可见分光光度法，立即在562nm波长处测定标准品溶液和供试品溶液的OD值；同时以0号管作为空白对照。

6.4.结果计算

6.4.1.计算标准品溶液在562nm处测量的OD值，以标准品溶液的浓度为X轴，OD值为Y轴，作直线回归曲线，求得回归方程和线性相关系数。线性相关系数R2应≥0.99，则数据有效。

6.4.2.将供试品溶液OD值分别代入标准曲线公式计算待测样品的蛋白质含量：

6.4.2.1.供试品为原液：依据以下公式计算：C(x) = [A(x)-b]÷a×n

式中 C(x)为供试品的蛋白质含量平均值（mg/ml）

     A(x)为供试品的OD

     b为标准曲线的截距

     a为标准曲线的斜率

     n为供试品总稀释倍数

6.4.2.2.供试品为成品：依据以下公式计算：C(x) = [A(x)-b]÷a×n×v

式中 C(x)为供试品的蛋白质含量平均值（mg/瓶）

     A(x)为待测样品的OD

     b为标准曲线的截距

     a为标准曲线的斜率

     n为供试品总稀释倍数

 为供试品复溶体积（ml/瓶）

6.5.判定标准

见各品种项下标准规定。

6.6.注意事项

6.6.1.购买的BCA蛋白质定量试剂盒中，已经带有BSA标准溶液，浓度为2.0mg/ml，建议在实际操作中使用自行配制的相应浓度的BSA标准品溶液。

6.6.2.由于不同次实验中，工作液的配置会有一定偏差，实验室温度也不会完全保持一致，所以每次样品测定时均需要重新制作标准曲线。

6.6.3.供试品溶液稀释时，为保证稀释准确，最大稀释倍数不要超过12倍，最小取样体积不要低于50μl。

6.6.4.为保证实验结果的准确性，严格控制对照品溶液与供试品溶液的反应时间，使其保持一致。

6.6.5.样品中若含有EDTA、EGTA、DTT、硫酸铵、脂质，会影响检测结果，高浓度的去垢剂也会影响实验结果，可用TCA沉淀去除干扰物质。

7.相关文件