一，免疫组织化学简介

免疫组织化学又称免疫细胞化学，是指带显色剂标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应炕原进行定性、定位、定量测定的一项新技术。它把免疫反应的特异性、组织化学的可见性巧妙地结合起来，借助显微镜(包括荧光显微镜、电子显微镜)的显像和放大作用，在细胞、亚细胞水平检测各种抗原物质(如蛋白质、多肽、酶、激素、病原体以及受体等)。

二，免疫组化技术的基本原理

免疫组化技术是一种综合定性、定位和定量；形态、机能和代谢密切结合为一体的研究和检测技术。在原位检测出病原的同时，还能观察到组织病变与该病原的关系，确认受染细胞类型，从而有助于了解疾病的发病机理和病理过程。

免疫酶组化技术是通过共价键将酶连接在抗体上，制成酶标抗体，再借酶对底物的特异催化作用，生成有色的不溶性产物或具有一定电子密度的颗粒，于普通显微镜或电镜下进行细胞表面及细胞内各种抗原成分的定位，根据酶标记的部位可将其分为直接法（一步法）、间接法（二步法）、桥联法（多步法）等，用于标记的抗体可以是用免疫动物制备的多克隆抗体或特异性单克隆抗体，最好是特异性强的高效价的单克隆抗体。直接法是将酶直接标记在第一抗体上，间接法是将酶标记在第二抗体上，检测组织细胞内的特定抗原物质。目前通常选用免疫酶组化间接染色法。

三，免疫组化步骤

1，切片，烤片60℃，1h；

2，脱蜡及复水

二甲苯10min，100％乙醇5min，95％乙醇5min，90％乙醇5min，85％乙醇5min，80％乙醇5min， 75％乙醇5min，60％乙醇5min，50％乙醇5min，30％乙醇5min，自来水1min，双氧水1min；

3，1份30％H2O2加10份蒸馏水，室温10min，蒸馏水洗3次，每次3min；

4，微波修复

将切片浸入0.01M枸橼酸缓冲液，微波中最大火力（98℃-100℃）加热至沸腾，冷却（约5-10min），反复两次；

5，将切片自然冷却至室温，PBS洗涤3次，每次5min；

6，封闭，5％BSA，室温20min，甩去多余液体；

7，滴加一抗，37℃，1h，或者4℃过夜；

8，PBS洗涤3次，每次3min；

9，滴加二抗，37℃，15-30min；

10，PBS洗涤3次，每次3min；

11，滴加SABC，37℃， 30min；

12，PBS洗涤3次，每次5min；

13，1ml蒸馏水中分别滴加显色剂，混匀；

14，DAB显色剂配置好后，滴加于切片，室温，镜下检测反应时间（约5min）；

15，自来水冲洗干净，过蒸馏水；

16，苏木素复染2min，自来水冲洗；

17，脱水

30％乙醇3min，50％乙醇3min，70％乙醇3min，80％乙醇3min，90％乙醇3min，95％乙醇3min，100％乙醇3min，二甲苯20min；

18，树胶封片，镜检。

四，免疫组化常见问题分析

1，石蜡切片在染色过程中出现脱片现象

  1）烤片时间不够，或温度不够，可以延长烤片时间和提高烤片温度；

  2）用含有多聚赖氨酸的玻片，可以购买到或这自己做；

  3）有些组织本身就容易掉片，如骨组织等，操作时冲PBS不要直接冲到组织上，冲到组织上方，让它流下冲洗组织；

  4）用高温修复时，温度骤冷也可能引起。

2，边缘效应

1）组织边缘与玻片粘贴不牢，边缘组织松脱漂浮在液体中，每次清洗不易将组织下面试剂洗尽所致. 解决办法：制备优质的胶片（APES或多聚赖氨酸），切出尽量薄的组织切片，不厚于4微米，组织的前期处理应规范，尽量避免选用坏死较多的组织；

2）切片上滴加的试剂未充分覆盖组织，边缘的试剂容易首先变干，浓度较中心组织高而致染色深。解决办法：试剂要充分覆盖组织，应超出组织边缘2mm。用组化笔画圈时，为了避免油剂的影响，画圈应距组织边缘3-4mm。

3，产生组织切片非特异性染色

   1）抗体孵育时间过长、抗体浓度高易增加背景着色。这可通过缩短一抗/二抗孵育时间、稀释抗体来控制。这是最重要的一条；

2）一抗用多克隆抗体易出现非特异性着色，建议试用单克隆抗体看看；

3）内源性过氧化物酶和生物素在肝脏、肾脏等组织含量很高（含血细胞多的组织），需要通过延长灭活时间和增加灭活剂浓度来降低背景染色；

4）非特异性组分与抗体结合，这需要通过延长二抗来源的动物免疫血清封闭时间和适当增加浓度来加强封闭效果；

5）DAB孵育时间过长或浓度过高；

6）PBS冲洗不充分，残留抗体结果增强着色，在一抗、二抗或SP孵育之后的浸洗尤为重要；

7）标本染色过程中经常出现干片，这容易增强非特异性着色。

4，免疫组化染色呈阴性结果

   1）抗体浓度和质量问题以及抗体来源选择错误；

   2）抗原修复不全，对于甲醛固定的组织必须用充分抗原修复来打开抗原表位，以利于与抗体结合；建议微波修复用高火4次*6min试试。有人做过实验，这是最佳的时间和次数。若不行，还可高压修复；

3）组织切片本身这种抗原含量低；

4）血清封闭时间过长；

5）DAB孵育时间过短；

6）细胞通透不全，抗体未能充分进入胞内参与反应；

7）开始做免疫组化，我建议你一定要首先做个阳性对照片，排除抗体等外的方法问题。

5，背景

1，考虑一抗浓度高；

2，然后调整DAB孵育时间；

3，也要考虑血清封闭时间是否过短；

4，适当增加抗体孵育后的浸洗次数和延长浸洗时间等。 

免疫组化的经验总结（1）－常见问题

免疫组化实验中常用的抗体为单克隆抗体和多克隆抗体。

1、免疫组化实验所用的组织和细胞标本有哪些？

实验所用主要为组织标本和细胞标本两大类，前者包括石蜡切片（病理大片和组织芯片）和冰冻切片，后者包括组织印片、细胞爬片和细胞涂片。其中石蜡切片是制作组织标本最常用、最基本的方法，对于组织形态保存好，且能作连续切片，有利于各种染色对照观察；还能长期存档，供回顾性研究；石蜡切片制作过程对组织内抗原暴露有一定的影响，但可进行抗原修复，是免疫组化中首选的组织标本制作方法。

2、石蜡切片为什么要做抗原修复？有哪些方法？

石蜡切片标本均用甲醛固定，使得细胞内抗原形成醛键、羧甲键而被封闭了部分抗原决定簇，同时蛋白之间发生交联而使抗原决定簇隐蔽。所以要求在进行IHC染色时，需要先进行抗原修复或暴露，即将固定时分子之间所形成的交联破坏，而恢复抗原的原有空间形态。常用的抗原修复方法有微波修复法，高压加热法，酶消化法，水煮加热法等，常用的修复液是pH6.0的0.01 mol/L的柠檬酸盐缓冲液。

3、免疫组化常用的染色方法有哪些？

根据标记物的不同分为免疫荧光法，免疫酶标法，亲和组织化学法，后者是以一种物质对某种组织成分具有高度亲合力为基础的检测方法。这种方法敏感性更高，有利于微量抗原(抗体)在细胞或亚细胞水平的定位，其中生物素——抗生物素染色法最常用。

4、抗体的保存：

 抗体储存容器应由不吸附蛋白质的材料制成，常用的有聚丙烯，聚碳酸酯和硼硅酸玻璃。如储存的抗体中蛋白浓度很低（10-100mg/L），就应另加隔离蛋白以减少容器对抗体蛋白的吸附，隔离蛋白常用0.1%-1.0%的牛血清白蛋白。绝大多数已稀释的抗体应存在4℃-8℃条件下，以免冻融对抗体蛋白产生有害效应。抗体原液和已分离的免疫球蛋白组分应保存于-20℃条件下，并避免反复冻融。冷冻的抗体溶液应置于室温中缓慢地解冻，应绝对避免用高温快速解冻。被细菌污染的抗体常会出现假阳性结果，应将污染的抗体溶液及其他试剂弃之。为防止细菌污染，可于抗体溶液中加入0.01%叠氮钠。抗体经真空冷冻干燥后置-20℃以下可保存3-5年。保存稀释后的单抗应加入0.1%叠氮钠浓度。大多数稀释抗体可进行冷冻保存，少数抗体可能会丢失抗原活性。大多数单抗，只要蛋白浓度适当，可在4℃下保存数月。

多聚赖氨酸溶液（Poly-L-Lysine Solution）　多聚赖氨酸溶液是广泛应用的组织切片与玻片黏合剂，该多聚阳离子分子与组织切片上的阴离子相互作用会产生较强的黏合力。适用组织学，免疫组织化学，冰冻切片，细胞涂片，原位杂交等使用的玻片的防脱片处理，以防实验操作过程中组织掉片。也可用于细胞培养，增加细胞贴壁能力。                  操作步骤（可直接在玻片上涂布）

1． 灭菌的ddH2O 1:10稀释该多聚赖氨酸溶液。

2． 用之前将稀释的多聚赖氨酸溶液放在室内，使其温度到室温18-26℃

3． 将玻片浸在稀释的多聚赖氨酸溶液5分钟。注意增加时间不会提高包被效果。

4．在60℃烘箱1小时干燥，或室温18-26℃过夜干燥待用。

[注意]

1． 每100mL已稀释的多聚赖氨酸溶液要包被的玻片40-90张， 超过90张片子将影响其黏合力。

2． 用之前的玻片必须保持清洁。必要时用含1% HCl的70%乙醇溶液来清洗。

4． 释过的多聚赖氨酸溶液要放在2-8℃，至少在3个月内是稳定的。

5． 用过的稀释液要过滤，若出现浑浊或长菌要丢弃。

免疫组化的经验总结（2）－操作规程

（一）、仪器设备   1）18cm不锈钢高压锅或电炉或医用微波炉； 2）水浴锅

（二）、试剂   

    1）PBS缓冲液（pH7.2～7.4）：NaCl 137mmol/L，KCl 2.7mmol/L，Na2HPO4 4.3mmol/L， KH2PO4 1.4mmol/L。

    2）0.01mol/L柠檬酸盐缓冲液（CB，pH6.0，1000ml）：柠檬酸三钠 3g，柠檬酸 0.4g。

    3）0.5mol/L EDTA缓冲液（pH8.0）：700ml水中溶解186.1gEDTA·2H2O，用10 mmol/L NaOH调至pH8.0,加水至1000ml。

    4）1mol/L的TBS缓冲液（pH8.0）：在800ml水中溶解121gTris碱，用1N的HCl调至pH8.0,加水至1000ml。

   5）酶消化液： a、0.1%胰蛋白酶液：用0.1%CaCl2(pH7.8) 配制。 b、0.4%胃蛋白酶液：用0.1N的HCl配制。

    6）3%甲醇-H2O2溶液：用30%H2O2和80%甲醇溶液配制。

   7）封裱剂：

     a、甘油和0.5mmol/L碳酸盐缓冲液（pH9.0～9.5）等量混合；

     b、油和TBS(或PBS)配制。  

    8）TBS/PBS pH9.0～9.5，适用于荧光显微镜标本；pH7.0～7.4适合于光学显微镜标本。 

（三）、操作流程

    1、脱蜡和水化

    脱蜡前，应将组织芯片在室温中放置60分钟或60℃恒温箱中烘烤20分钟。

    1）组织芯片置于二甲苯中浸泡10分钟，更换二甲苯后再浸泡10分钟；

    2）无水乙醇中浸泡5分钟；3）95%乙醇中浸泡5分钟；4）70%乙醇中浸泡5分钟；

   2、抗原修复   用于固定的石蜡包埋组织芯片。

   1）抗原热修复

   （1）高压热修复 在沸水中加入EDTA（pH8.0）或0.01M枸橼酸钠缓冲溶液（pH6.0）。盖上不锈钢高压锅的盖子，但不进行锁定。将玻片置于金属染色架上，缓慢加压，使玻片在缓冲液中浸泡5分钟，然后将盖子锁定，小阀门将会升起来。10分钟后，去除热源，置入凉水中，当小阀门沉下去后打开盖子。本方法适用于较难检测或核抗原的抗原修复。

   （2）煮沸热修复 电炉或者水浴锅加热0.01M枸橼酸钠缓冲溶液（pH6.0）至95℃左右，放入组织芯片加热10~15分钟。

   （3）微波热修复 在微波炉里加热0.01M枸橼酸钠缓冲溶液（pH6.0）至沸腾后将组织芯片放入，断电，间隔5~10分钟，反复1-2次。适用的抗原有：AR，Bax，Bcl-2，C-fos，X-jun，C-kit，C-myc，E-cadherin，p53，p34，p16，p15，P-glycoprotein，PKC，PR，PCNA，ras，Rb，TopoismeraseⅡ等。是以高温，高压对常规固定的石蜡切片进行抗原修复或复原的一种非蛋白酶消化以提高抗原抗体阳性检测的一种方法和技术手段。甲醛和蛋白水解交联过程中氨基酸侧链上的某些基团(抗原决定簇)如咪唑、吲哚等基团受到影响，通过120℃高温或强碱处理后，可使交联打开。

   2）酶消化方法 常用0.1%胰蛋白酶和0.4%胃蛋白酶液。胰蛋白酶使用前预热至37℃，切片也预热至37℃，消化时间约为5~30分钟；胃蛋白酶消化37℃时间为30分钟。适用于被固定遮避的抗原，其中有：Collagen，Complement，Cytokeratin，C-erB-2，GFAP，LCA，LN等。

    3、免疫组织化学染色

    SP法    1）脱蜡、水化；

    2）PBS洗2～3次各5分钟；

    3）3%H2O2（80%甲醇）滴加在TMA上，室温静置10分钟；

    4）PBS洗2～3次各5分钟；

    5）抗原修复；

    6）PBS洗2～3次各5分钟；

    7）滴加正常山羊血清封闭液,室温20分钟。甩去多余液体。

    8）滴加Ⅰ抗50μl，室温静置1小时或者4℃过夜或者37℃1小时。

    9）4℃过夜后需在37℃复温45分钟。

    10）PBS洗3次各5分钟；

    11）滴加Ⅱ抗40～50μl，室温静置，或37℃1小时；

    12）II抗中可加入0.05%的tween-20。

    13）PBS洗3次各5分钟；

    14）DAB显色5～10分钟，在显微镜下掌握染色程度；

    15）PBS或自来水冲洗10分钟；

    16）苏木精复染2分钟，盐酸酒精分化；

    17）自来水冲洗10～15分钟；

    18）脱水、透明、封片、镜检。

    SABC法    1)脱蜡、水化。

    2)PBS洗两次各5分钟。

    3)用蒸馏水或PBS配置新鲜的3%H2O2，室温封闭5～10分钟，蒸馏水洗3次。

    4)抗原修复。

    5)PBS洗5分钟。

    6)滴加正常山羊血清封闭液，室温20分钟。甩去多余液体。

    7)滴加Ⅰ抗,室温1小时或者4℃过夜或者37℃1小时（4℃过夜后在37℃复温45分钟）。

    8)PBS洗三次每次2分钟。

    9)滴加生物素化二抗,20℃～37℃20分钟。

    10)PBC洗3次每次2分钟。

    11)滴加试剂SABC，20℃～37℃20分钟。

    12)PBS洗4次每次5分钟。

    13)DAB显色：DAB显色试剂盒或者自配显色剂显色（镜下掌握显色程度）。

    14)蒸馏水洗。苏木素复染2分钟、盐酸酒精分化。

    15)脱水、透明、封片、镜检。

免疫组化的经验总结（3）－操作要点和技巧

1．  固定：最好用4%的多聚甲醛固定液。对于冰冻切片，甲醛固定有时比冰冻丙酮好；但对于不同的组织和抗原，可选用不同的固定液。 有时候商品化的抗体会有比较适合而推荐的固定液，请于购置前注意说明书。

Bouin S固定液：饱和苦味酸750ml，甲醛250ml，冰醋酸50ml，其对组织的穿透力较强，固定较好，结构完整，但因偏酸，对抗原有一定损害，且组织收缩明显，不适于组织标本的长期保存。

PLP液：即高碘酸钠-赖氨酸-多聚甲醛，适于固定石蜡切片。适于富含糖类组织，对超微结构及许多抗原的抗原性保存较好。

2． 组织脱水，透明：时间不能太长，否则在切片时容易碎片，切不完整。

3．切片时展片：有些组织在切片后难以在水中展开，这时可适当地在水中加入几滴乙醇。

4．烤片：60℃ 30分钟或37℃ 过夜，温度太高或时间太长，抗原容易丢失。

5．蜡块及切片的保存：最好在4℃保存

6．脱片问题： Poly-L-Lysine(多聚赖氨酸)为目前免疫组化染色工作中最常用的一种防脱片剂，6ml的多聚赖氨酸溶液可按1:10稀释成60ml的工作液，适合于需要酶消化、微波、高温高压的防脱片处理。如不行，可用双重处理（APES和Poly-L-Lysine）的切片。在以上两种条件都行不通的情况下，可用如下方法：切片在脱蜡前，放在APES 1：50 丙酮溶液中浸泡3分钟，晾干，即可进行下一步。

7．灭活内源性酶：HRP系统：3%双氧水灭活；AP系统：3%HAc灭活。

8．暴露抗原：对于石蜡切片的免疫组化实验时，必须采用高温加热抗原修复，这将有助于暴露抗原决定簇，从而增加免疫组化染色的强度(不同抗体的最佳修复液请参阅抗体说明书)。对于不同的组织，不同的抗原，不同的抗体，所采用的方法应不一样，可进行热修复、胰酶消化、既不修复也不消化。胶原还可以用胃蛋白酶消化等。

9．封闭：在山羊血清封闭，非特异性染色仍然较强时，可延长封闭时间或用浓缩血清封闭

10．抗体稀释：应遵循“现用现配”的原则，对于PBS稀释的抗体一定要当天使用。

11．背景高：在抗体浓度、反应时间、反应温度等合适的条件下，如果背景依旧高，可采用含1‰ Tween20的PBS洗，特别是在显色之前要多洗。

12．返蓝：在苏木素复染后，可用碱性缓冲液（如PBS）或Na2HPO4的饱和溶液返蓝。

13．显色：一定要在显微镜下观察，注意控制背景。

DAB法显示过氧化物酶

〔原理〕  过氧化物酶分解H2O2的过程中，下面反应不直接发生：AH2（供氢体）+H2O2→A（供氢体的氧化物）+2H2O2实验可知，有称为复合物 Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、的酶——底物（受氢体）复合体生成，在复合体最后分解为酶和水时，游离的原子氧使供氢体氧化而显色。酶组织化学中所使用的供氢体应是含有色原性基团的发色物质，如奈酚和联苯胺。

免疫组化染色步骤（以ABC法为例）

溶液的配置：

1. 0.1M PBS 2000ml：NaCL 18g, NaH2PO4·2H2O 0.8g, Na2HPO4·12H2O 12g. 共六份

2. 柠檬酸盐缓冲液：

贮存液：0.1M柠檬酸溶液（A）：21.01g 柠檬酸 + 1L 蒸馏水

        0.1M柠檬酸三钠溶液（B）：29.41g 柠檬酸三钠 + 1L 蒸馏水

工作液：9ml A液+41ml B液+450ml 蒸馏水→0.01M柠檬酸盐缓冲液

3. 0.03% H2O2-甲醇：30% H2O2 0.4ml + 400ml 纯甲醇→充分混匀

4. 20% 甘油：80ml 纯甘油 + 320ml 蒸馏水

5. 稀释抗体：1︰300 ，1︰400 ，1︰600 （临用前配）

6. 酒精的配置

染色步骤：一步法

1. 载玻片 烤箱中 60℃ 40′。

2. 二甲苯Ⅰ，60℃ 20′(水浴箱中)，二甲苯Ⅱ，室温 15′。

3. 脱水，100%→95%→85%→75%酒精，每级均为3′。

4. 蒸馏水冲洗，PBS 5′﹡1

5. 微波炉修复抗原：0.01M 柠檬酸盐缓冲液，99℃ 肺 20′，心肾 12′

6. PBS 3′*3

7. 0.03% H2O2-甲醇，室温20′

8. PBS冲洗，PBS 3′*3，甩干或纸巾吸去多余液体（勿碰到组织），PAP Pen划境线。

9. block solution 封闭抗原，室温10′。

10. 倾出封闭液，不洗，滴加一抗（60ul），4℃过夜或37℃ 1～2h。

11. PBS冲洗，3′*3。

12. 除去PBS，滴加A增强剂，室温25′。

13. PBS冲洗，3′*3。

14. 除去PBS，滴加B剂，室温35′。

15. PBS冲洗，3′*3。同时配置DAB显色剂。

16. 除去PBS，DAB显色10′（在显微镜下观察染色程度控制染色时间）。蒸馏水冲洗。

17. 复染：苏目素均匀滴加2滴，40′′，蒸馏水冲洗，60℃温水泡半分钟。

18. 脱水：75%酒精→85%→95%→100%（3次），每级3′。

19. 透明：二甲苯Ⅰ3′，二甲苯Ⅱ3′。

18. 封片：中性树脂，加盖玻片（组织部位切勿残留小气泡），60℃ 0.5h烘干。

结果：棕褐色反应产物代表抗原X的定位。

拍照

1. 更换样品时，除了调整焦距和视野外，显微镜上的其他部件都不能动！所有的样品必须一次拍摄完全。特别是在拍摄过程中，不要一会用高倍镜，一会用低倍镜，来回切换物镜。

2. 数码相机必须设置为手动曝光，并且保持每张照片用同样的曝光条件，同样的曝光时间，同样的光圈。特别要注意的是，一定要将数码相机的自动白平衡功能给关掉

3. 免疫组化切片一般染色不太深，因此拍摄出的照片颜色较浅，就让它浅。拍摄出的照片中空白部位应尽可能呈现纯白色。测量其灰度应在250左右。如果呈现淡蓝色，一般是相机自动白平衡在起作用。另外一个因素是显微镜灯光电压不正确。要使灯光本身的色温正确。既不偏黄，也不偏蓝。下载本文