非原代培养的细胞一般冻存于液氮之中，需要培养时要先从液氮中取出使之复苏。细胞复苏的原则——快速融化：必须将冻存在－196℃液氮中的细胞快速融化至37℃，使细胞外冻存时的冰晶迅速融化，避免冰晶缓慢融化时进入细胞形成再结晶，对细胞造成损害。

具体操作如下： 

1、实验前准备：

1.1、将水浴锅预热至37℃，并将含10%FBS的培养液置于其中预热；。

1.2、用75％酒精擦拭紫外线照射30min的超净工作台台面。

1.3、在超净工作台中按次序摆放好消过毒的离心管、吸管、培养瓶等等。

2、取出冻存管及迅速解冻：

2.1、根据细胞冻存记录按标签找到所需细胞的编号。

2.2、从液氮罐中取出细胞盒，取出所需的细胞，同时核对管外的编号。

2.3、迅速将冻存管投入到已经预热的水浴锅中迅速解冻，并要不断的摇动，使管中的液体迅速融化，约1-2min后冻存管内液体完全溶解，取出用酒精棉球擦拭冻存管的外壁，再拿入超净台内。

3、平衡离心 将细胞悬液吸到离心管中，1000～1500rpm离心3分钟；

4、制备细胞悬液 吸去上清液，加入10 ml培养液，用吸管轻轻吹打均匀，使细胞悬浮；

5、细胞计数 细胞浓度以5×105/ml为宜。

6、培养细胞 将复合细胞计数要求的细胞悬液吸到培养瓶中，将培养瓶放入37℃和5％CO2的培养箱内培养（略微拧松培养瓶盖），换液的时间由细胞情况而定。通常，除少数特别注明对DMSO 敏感的细胞外， 绝大部分细胞株（包括悬浮性细胞）， 在解冻之后， 可直接放入含有10-15ml（5－10倍）新鲜培养基的培养角瓶中， 待隔天再置换新鲜培养基以去除DMSO 即可， 如此可避免大部分解冻后细胞无法生长或贴附的问题。

二、细胞的传代：

培养的细胞生长至一定密度之后，由于培养液中营养逐渐消耗、代谢物逐步积累（可见到培养液变黄），而且细胞的生长空间也受到，就会影响到细胞的继续生存。这时就需要分离出一部分细胞和更新培养液，这一过程就叫做传代。

1、贴壁细胞的传代

具体操作如下：

1.1、传代前准备：

1.1.1、预热培养用液：把装有培养液、PBS和胰蛋白酶的瓶子放入37℃水浴锅内预热。

1.1.2、用75％酒精擦拭双手和经过紫外线照射的超净工作台

1.1.3、正确摆放使用的器械：保证足够的操作空间，不仅便于操作而且可减少污染。

1.1.4、点燃酒精灯：注意火焰不能太小。

1.1.5、准备好将要使用的已灭菌的空培养瓶。

1.1.6、取出已经预热好的培养用液，用酒精棉球擦拭好后方能放入超净台内。

1.1.7、从培养箱内取出细胞，注意取出细胞时要旋紧瓶盖，用酒精棉球擦拭显微镜的台面，再在镜下观察细胞，并做好记录。

1.1.8、细胞培养瓶经用75％酒精擦拭后，再放入超净台。

1.2、胰蛋白酶消化：

1.2.1、将瓶盖过酒精灯火焰消毒后，打开瓶盖，靠近酒精灯，小心吸出旧培养液，用PBS清洗2－3次，沿壁（无细胞的一面）缓缓加入适量消化液（胰蛋白酶液），轻轻摇晃。注意消化液的量以盖住细胞最好，最

佳消化温度是37℃。 

1.2.2、显微镜下观察细胞：倒置显微镜下观察消化细胞，若胞质回缩，细胞之间不再连接成片，表明此时

细胞消化适度。

1.3、吹打分散细胞：

1.3.1、弃去大部分消化液（仅留少量在瓶内），并轻轻拍打培养瓶，使细胞分散，然后加入新鲜的培养液，

再用吸管轻轻吹打成细胞悬液（尽可能不要出现泡沫，否则对细胞有损伤〕

1.4、分装稀释细胞

1.4.1、将细胞悬液吸出分装至2-3个培养瓶中，加入适量培养基旋紧瓶盖。

1.4.2、倒置显微镜下观察细胞量，必要时计数。注意密度过小会影响传代细胞的生长，传代细胞的密度应该不低于5×105/ml。最后在瓶上做好标记，如细胞代数、日期及姓名等。

1.5、继续培养：

1.5.1、用酒精棉球擦拭培养瓶，适当旋松瓶盖，放入CO2培养箱中继续培养。传代细胞2小时后开始贴附在瓶壁上。当生长细胞铺展面积占培养瓶底面积25％时为一个＋，占50％为＋＋，占75％时为＋＋＋。

2、悬浮细胞的传代

悬浮细胞可以直接将培养瓶中的液体吸掉，只留下少量，然后加入新鲜培养液即可。 当细胞悬液中碎片或颗粒物较多，感觉到比较脏时，可以将悬液移到离心管内，1000～1500rpm离心3分钟，弃上清，加入约2ml培养液，吹打至均匀，滴加2-3滴至已加入新鲜培养液的培养瓶中。然后置于二氧化碳培养箱中培养（拧松培养瓶盖）。

三、细胞的冻存

细胞冻存的原则是要逐步缓慢降温，以避免细胞内部形成冰晶对细胞造成伤害。 

1、具体操作如下：

1.1、从增值期到形成致密单层以前的细胞都可以用于冻存，但最好选择对数增长期细胞，已长满的细胞冻存复苏后生存率低。在冻存前一天最好换一次培养液。

1.2、贴壁细胞经消化、离心（1000～1500rpm，5min）收集，悬浮细胞经离心收集；

1.3、大约106个细胞加入1ml冻存液（10％DMSO+90%血清），用吸管吹打，使细胞分散成单细胞悬液；

1.4、加入到冻存管中，每个冻存管加1－1.5ml的细胞悬液；密封；

1.5、在冻存管上标明细胞名称及冻存日期；

1.6、将冻存管直立放置于塑料盒或纸盒内，管置于4℃半小时，然后置于-20℃两小时，再置于-70℃两小时，然后置于液氮上方过夜；第二天将细胞置于液氮中；

1.7、记下冻存管存放的位置，作好冻存记录（冻存的细胞名称、代数、冻存日期等）。

2、注意事项：

2.1、使用DMSO前，不需要进行高压灭菌，它本身就有灭菌的作用。高压灭菌反而会破华它的分子结构，以至于降低冷冻保护效果。在常温下，DMSO对人体有害，故在配制时最好戴上手套操作。

2.2、不宜将冻存细胞放置在0℃～-60℃这一温度范围内过久，低温损伤主要发生在这一温度区内，是“危

险温区”。

2.3、注意定期检查液氮罐内液氮量，及时添加。

2.4、细胞在液氮中贮存的时间理论上是无限的。但为妥善起见，特别是很多未被冻存过的细胞在首次冻存

后要在短期内复苏一次，观察细胞对冻存的适应性。已建系的细胞最好也每年取一支复苏一次后，再继续

冻存。

四、细胞计数

实验原理：当待测细胞悬液中细胞均匀分布时，通过测定一定体积悬液中的细胞的数目，即可换算出每毫升细胞悬液中细胞的细胞数目。

具体操作如下：

1、准备工作：取一瓶传代的细胞，按上述二的传代方法繁殖细胞，待长成单层后以使用。

2、细胞悬液制备：细胞悬液的制备方法：用0.25％的胰蛋白酶液消化、PBS液洗涤后，加入培养液（或Hanks液或PBS等

平衡盐溶液），吹打制成待测单细胞悬液。

3、细胞计数：

2.1、盖好盖玻片：取一套血球计数板，将特制的盖玻片盖在血球计数槽上。

2.2、制备计数用的细胞悬液：用吸管吸适量细胞悬液（如5滴）到一离心管中，加入等体积台盼蓝染液（0.4％）或苯胺黑，活细胞不会被染色，加入染液后就可以在显微镜下区别活细胞和死细胞。若仅是单纯的进行细胞计数，不考虑细胞的活力，则可省略台盼蓝染色步骤。

2.3、、将细胞悬液滴入计数板：将待测细胞悬液吹均匀，然后吸取少量悬液沿盖片边缘缓缓滴入，要保证盖片下充满悬液，注意盖片下不要有气泡，也不能让悬液流入旁边槽中。

2.4、统计四个大格的细胞数：将血球计数板放于显微镜的低倍镜下观察，并移动计数板，当看到镜中出现计数方格后，数出四角的四个大格（每个大格含有16个中铬）中没有被染液染上色的细胞数目。

2.5、计算原细胞悬液的细胞数:按照下面公式计算细胞密度：

（细胞悬液的细胞数）/ml＝ （四个大格子细胞数/4) ×2×104

说明：公式中除以4因为计数了4个大格的细胞数。

公式中乘以2因为细胞悬液于染液是1：1稀释。

公式中乘以104因为计数板中每一个大格的体积为：

1.0mm（长）×1.0mm（宽）×0.1mm（高）＝0.1mm3 ；而1ml＝1000mm3

细胞计数要点：

①进行细胞计数时，要求悬液中细胞数目不低于104个/ml，如果细胞数目很少要进行离心再悬浮于少量培

养液中；

②要求细胞悬液中的细胞分散良好，否则影响计数准确性。

③取样计数前，应充分混匀细胞悬液，尤其时多次取样计数时更要注意每次取样都要混匀，以求计数准确；

④数细胞的原则是只数完整的细胞，若细胞聚集成团时，只按照一个细胞计算。如果细胞压在格线上时，则只计上线，不计下线，只计右线，不计左线。

⑤操作时，注意盖片下不能有气泡，也不能让悬液流入旁边槽中，否则要重新计数。

注：4％台盼蓝母液的配制：

称取4克台盼蓝，加入少量蒸馏水研磨，加双蒸水至100毫升，用滤纸过滤，4℃保存。使用时，用PBS稀释至0.4％。

五、细胞活力的测定

1.染料排斥试验： 

其原理是细胞损伤或死亡时，某些染料可穿透细胞膜，与解体的DNA结合，使其着色。而活细胞则能阻止该染料进入细胞内。借此可鉴别死细胞和活细胞。常用的染料有台盼蓝、伊红Y和苯胺黑等。

以台盼蓝染色为例。步骤同上述细胞计数的操作步骤。注意以下几点:

①计数：在3－10min内，用血球计数板分别计数活细胞和死细胞（死细胞被染成淡蓝色，活细胞则拒染）。

②台盼蓝染色时，时间不宜太长，否则活细胞也会着色，从而干扰计数。

③活细胞率（％）＝活细胞总数/(活细胞总数＋死细胞总数)×100％

2、MTT比色实验：可测定测药物或病毒的IC50

原理：活细胞线粒体琥珀酸脱氢酶催化四甲基偶氮唑盐(MTT)，还原成紫色不溶性结晶物，沉积于细胞中。用酸性异丙醇或DMSO溶解后，于酶标仪上测定光吸收值。紫色不溶性结晶物形成的多少与活细胞数目和功能状态相关。

2.1、将细胞接种于96孔板上，密度为大约105个/ml，每孔接种100μl；

2.2、培养至对数生长期加入待测样品；

2.3、作用一定的时间之后，加入三蒸水配制的5μg/ml的MTT溶液，每孔20μl；

2.4、37℃温育4小时；

2.5、取出培养板，小心吸去上清，注意不要吸掉底部的蓝紫色沉淀；如果是悬浮细胞则用板离心机离心后除去上清；

2.6、每孔加入100μl的DMSO，摇床上摇动30分钟以使沉淀溶解；

2.7、用酶联免疫检测仪（DNA Expert）在595nm（或490nm）波长处检测96孔平板中每孔细胞的光密度值

（OD值），按下列公式计算药物或病毒对细胞生长的抑制率： 

细胞存活率（％）＝治疗组OD值/ 对照组OD值×100％

2.8、求出各药物（或病毒）浓度下的OD值占对照OD值的百分比，用此百分比对药物（或病毒）浓度作图；

在所得的曲线上，百分比值为50时所对应的浓度就是IC50值。或根据各浓度下细胞的存活率，采用Logit

法计算IC50。

六、细胞的运输

装运细胞的方法有两种：

1、冷冻贮存运输

即利用特殊内内盛液氮或干冰冻存，保存效果较好，但较麻烦，且不能长时间运输，多需空运。

2、充液法

2.1、选生长状态良好的细胞，去掉培养液，充满新培养液，液量要达到培养瓶颈部，拧紧螺帽或塞以胶塞，

保留微量空气。若空气留量过多，运输时大气泡来回流动对细胞有干扰作用。

2.2、妥善包装、运输。一般在四五天内到达目的地，对细胞活力无多大影响，时间过长则细胞活力下降。 

2.3、到达目的地后，倒出大部分培养液，保留维持细胞生长所需的液量，置37℃培养, 次日传代。

注：从其他研究室所取细胞时，应注意了解细胞的性状、培养液、培养时的注意事项等

1、转染前细胞的处理（以24孔板培养为例）：

贴壁细胞：在转染前一天，在24孔板内铺上0.5×105细胞，500ul无抗生素培养基培养一天，到转染时使细胞达到80％～90％的汇合率。

悬浮细胞:在制备混合物前，将4—8×105细胞用无抗生素培养基培养铺铺于24孔板内。

2、转染方法（以质粒DNA转染为例）

2.1、将DNA质粒溶于50ul无血清的Opti－MEM Ⅰ Reduced Serum Medium中。混合均匀。

2.2、将适量Lipofectamine 2000溶于50ul无血清的Opti－MEM Ⅰ中，混合均匀。在室温下孵育5分钟（在25分钟内进行步骤c）。

2.3、孵育5分钟后，将上述两种混合物混合（总体积100ul）。轻轻混合均匀在室温下孵育25分钟（可能出现雾状沉淀）。复合无在室温下六小时内稳定。

2.4、在24孔板中每孔加入100ul的复合物以及适量培养基。十字法混合均匀。

2.5、细胞在37。C CO2培养箱中培养18－48个小时后，测量转染效率。在加完复合物4－6小时候可更换培养基。 

3、转染注意事项

3.1、转染严格来说，每种细胞的条件是不一样的，如果实验时，不能确定最佳转染条件，请在细胞实验组共享文件夹查找类似细胞的转染方法；

3.2、转染结果的好坏，与DNA质量密切相关，务必在实验之前对去内毒素质粒DNA的质量进行严格鉴定，至少采用以下两种方法：琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度检测，如果有条件，可对质粒DNA去内毒素质量的进行检测。

1.1、细胞样品（1.0×107个）去上清之后，加入1ml TRIzol溶液反复吹打至溶液清亮，转移入1.5ml Tube中室温下放置10min，如不能立即提取则放于-80℃保存（可保存一个月），提取时取出放于室温融化；也可按照正常冻存方法保存1×107个细胞，提取时37℃迅速融化，5000rpm离心3min去除上清液后迅速加入1ml TRIzol溶液反复吹打至溶液清亮，室温下放置10min；

1.2、加入200ul氯仿（1/5TRIzol体积），先用混匀10-15下，再充分颠倒混匀2min，使两相充分混合，室温静置3min；

1.3、4℃、10000g（12000rpm）离心15min；

1.4、小心吸取上清（中间有厚厚的蛋白层）至一新的1.5ml Tube中（可取干净），加入0.5ml异丙醇（1/2 TRIzol体积）先用混匀10-15下，再充分颠倒混匀2min，室温放置10min；

1.5、4℃、10000g（12000rpm）离心10min；

1.6、小心吸去上清液（注意不要吸起白色沉淀），加入1ml 70%乙醇（-20℃预冷）旋转漂洗RNA沉淀；

1.7、4℃、10000g（12000rpm）离心5min；

1.8、小心吸去上清液，空气中干燥2-3min，加入84ul DEPC水充分溶解RNA（如溶解困难，4℃放置过夜）；[将RNA稀释5倍，电泳，]

（若是对RNA的质量要求不高，做到这一步即可，以下是纯化的步骤）

依次加入2ul RNase Inhibitor〈40U/ul〉，10ul 10×DNase I Buffer，4ul DNase I 〈RNase Free〉〈5U/ul〉，充分混匀后37℃反应60min；

1.9、补加200ul DEPC水至总体积300ul，再加入300ul PCI（DEPC水饱和），充分混匀5min，室温10000g（12000rpm）离心10min；

1.10、小心取上清(几乎看不见中间层，取的较干净)于一新的1.5ml Tube中，再加入300ul CI，充分混匀5min，室温10000g（12000rpm）离心10min；

1.11、小心取出上清液(几乎看不见中间层，取的较干净)于一新的1.5ml Tube中，加入30ul 3M CH3COONa充分混匀1min后加入750ul无水乙醇（-20℃预冷），充分混匀2min，-20℃放置40min；

1.12、4℃、10000g（12000rpm）离心15min，小心取出上清（可用取干净）；

1.13、加入1ml 70%乙醇（DEPC水配制）（-20℃预冷），旋转振荡清洗RNA沉淀，4℃、10000g（12000rpm）离心10min；

1.14、小心吸去上清液，室温干燥2-3min，加入80ul DEPC水溶解；

1.15、分别取2ul RNA溶液溶于10ul DEPC水中，混匀后各取出5ul进行1%琼脂糖凝胶电泳，根据电泳结果判定RNA是否有降解；

1.16、按照电泳结果估计RNA浓度，按比例使用TE Buffer (PH 8.0) 稀释到0.3至0.5OD吸光度范围内； 

二、实验注意事项

1.1、整个实验过程中应该使用橡胶手套和口罩，实验前，使用70%乙醇擦拭双手和工作台以及实验用品；

1.2、实验用试剂必须保证质量，对pH值有要求的必须以灭菌后的测量值为准；

1.3、贵重的样品，抽完之后，必须取出一定量作为实验室保存；

1.4、必要时，可以将头剪掉一部分使用，以免RNA大量断裂。

实验中主要用来溶解稀释固体试剂，形成含有缓冲体系的盐离子溶液 

二、配制，使用和保存方法

1、溶液配制

按1L的标准量配制

称取下列药品：

NaCl 8.0g

Na2HPO4 1.15g

KCl 0.2g

KH2PO4 0.2g

溶解、定容，使用实验室用超纯水；

2、除菌

实验室采用过滤灭菌，使用0.22μm的除菌膜；

4℃保存。

3、使用

使用过程中应该保证严格的无菌操作，为了防止污染，可用50ml无菌离心管对dPBS进行分装。

细胞培养相关实验中，为了防止培养过程中出现细菌污染，需要在培养基中添加双抗，即青霉素和链霉素。

1、药物使用浓度

根据细胞种类的不同，一般（P/S）的终浓度保持在100U/ml,具体的实验过程中，可以根据细胞对抗生素的敏感程度减少或增加双抗用量，原则来说，抗生素的使用范围为：50U/ml-200 U/ml。

2、药物配制方法（干粉状的抗生素）

2.1、药物溶解

使用少量的dPBS溶液溶解干粉状的抗生素，溶解过程中，应尽量减少dPBS的用量，使药物保持在较高浓度；

2.2、溶液除菌

使用0.22μm的除菌膜过滤，然后分装，-20℃保存。

2.3、日常使用

按实验要求的终浓度将抗生素溶液添加到培养基当中，注意无菌操作。

2.4、注意事项

①总的原则是现用现配，尽量减少溶液反复冻融次数，防止抗生素失效；

②培养基最好是现用现配，在含有血清的完全培养基中，添加抗生素，应4℃保存且有效使用期不能超过1个月。

③抗生素并非越多越好，在实验细胞条件不明确之前，应该先从最小使用量开始。

二、真核细胞用抗生素

本实验室现在常用的真核用筛选标记物主要有两种：neomycin（G418） 和Puromycin，实验中主要用来筛选细胞稳定株或者阳性细胞群落。

1、药物配制和保存方法如下：

本实验室使用dPBS，pH 7.3

液体保存：Following reconstitution, sterilize by filtration through a 0.22μm or 0.45 μmm pore size filter, aliquot and freeze (-20°C) for long term storage or refrigerate (+4°C) for short-term storage. assupplied. Sterile stock solutions are stable for at least 1 year at +4°C.

supplied.

本实验室使用dPBS，pH 7.3

液体保存：Stock solutions are stable for up to 3 months 

at -20℃.

实验室在接到产品时，在正式使用之前，应该进行如下质量检测程序

1、运输条件：收到培养基之后，先检查运输条件是否合理，正常状况下应该为4℃运输。

2、产品外观：检查封口是否完好，晃动液体，观察溶液是否澄清，正常情况下，溶液应该是澄清，均一的。

3、污染物检测：一般在无菌条件下，取5ml培养基于6cm细胞培养皿，于CO2培养箱中条件进培养96小时，定期检查溶液是否边浑浊，正常情况下，溶液应该是始终澄清均仪的。 

二、完全培养基的配制和使用 

1、完全培养基的配制

通常状况下，在购买的培养基溶液里添加胎牛血清，抗生素，特殊营养成分等，形成完全培养基。实验室采用的标准如下：