【实验原理】
考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度，是利用蛋白质-染料结合的原理。考马斯亮蓝G-250染料，在酸性溶液时呈茶棕色，最大吸收峰在465nm。当与蛋白质结合后变成深蓝色，最大吸收峰转至595nm，且其光吸收值与蛋白质含量（10~100μg/ml蛋白质浓度）成正比，因此可用于蛋白质的定量测定。
该方法灵敏度高，其最低蛋白质检测量可达1μg。这是因为蛋白质与染料结合后产生的颜色变化很大，蛋白质-染料复合物有更高的消光系数，因而光吸收值随蛋白质浓度改变的变化很大。
由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此Bradford法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差。
【实验准备】
一、试剂
（1）考马斯亮蓝试剂：称取考马斯亮蓝G-250 100mg溶于50ml 95%乙醇中，加入100ml 85%磷酸，用蒸馏水稀释至1000ml。
（2）生理盐水：0.9% NaCl溶液。
（3）标准蛋白质溶液：牛血清蛋白（BSA），用0.9% NaCl稀释成0.1mg/ml蛋白标准溶液。
二、器材：
试管和试管架、紫外分光光度计、移液、漩涡振荡器
【实验步骤】
一、制作标准曲线
取7支干燥洁净的试管，编号按下表加入试剂
| 编号 | 0 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 |
| 标准蛋白质溶液/ml | 0 | 0.1 | 0.2 | 0.4 | 0.6 | 0.8 | 1.0 |
| 生理盐水/ml | 1 | 0.9 | 0.8 | 0.6 | 0.4 | 0.2 | 0 |
| 考马斯亮蓝试剂/ml | 5 | 5 | 5 | 5 | 5 | 5 | 5 |
| 编号 | 蛋白浓度（ug/mL） | 吸光度（A595） |
| 1 | 10 | 0.152 |
| 2 | 20 | 0.199 |
| 3 | 40 | 0.332 |
| 4 | 60 | 0.457 |
| 5 | 80 | 0.571 |
| 6 | 100 | 0.667 |
二、蛋白质含量的测定：
样品即所测蛋白质含量样品（含量应处理在所测范围内），依照标准曲线操作，测出样品的A595nm，然后利用标准曲线对应回归方程求出样品蛋白质含量。
一般被测样品的A595nm值在0.2-0.8之间，所以上述样品如果A595nm值太大，可以稀释后再测A595nm值，然后再计算。
【注意事项】：
1、玻璃仪器要洗净且干燥，确保无蛋白质、SDS、Tris、乙酸、2-巯基乙醇、EDTA及微量的去污剂如TritonX-100等污染或干扰实验结果。
2、测定完后用乙醇将玻璃比色皿清洗干净。
3、所测样品的A595nm值应在0.2-0.8之间，否则需要稀释后检测。
4、必须在试剂加入后的5~20min内测定光吸收，因为在这段时间内颜色是最稳定的。
5、每次配制考马斯亮蓝染色液后都需要制作标准曲线。下载本文
