一 实验目的

掌握利用赤霉素(GA3)诱导合成的ａ-淀粉酶降解淀粉,使淀粉遇碘呈蓝紫色的颜色反应减弱来测定ａ-淀粉酶活性的方法.加深对赤霉素诱导ａ-淀粉酶合成的生理特性的认识.

二  实验原理 

大麦种子萌发时,胚乳内储藏的淀粉发生水解作用,产生还原糖.目前已经清楚,赤霉素是诱导大麦,糊粉层细胞内ａ-淀粉酶合成的化学信使.当种子吸胀后,首先由胚分泌赤霉素,并释放到胚乳的糊粉层细胞中,诱导ａ-淀粉酶的合成.新合成的ａ-淀粉酶进入胚乳,可催化胚乳中储存的淀粉水解形成短链糊精,少量麦芽糖及葡萄糖,为种子的萌发和幼苗的生长提供能量物质.

外加的GA3能代替胚所分泌的赤霉素的作用,诱导胚乳糊粉层细胞ａ-淀粉酶的合成.在一定的浓度范围内,加入GA3的量与合成的ａ-淀粉酶活性成正比.根据淀粉遇碘呈蓝紫色的反应特性,可以检验ａ-淀粉酶活性.本实验利用GA3诱导种子合成的ａ-淀粉酶,降解淀粉酶,降解淀粉使蓝紫色消失的反应,来判断GA3对ａ-淀粉酶的影响.

三、实验材料

小麦（或大麦）种子。

四、设备与试剂

分光光度计，恒温箱，试管，青霉素瓶，移液管，烧杯，镊子，单面刀片，试管架；1%次氯酸钠溶液。

淀粉磷酸盐溶液：可溶性淀粉1g和KH2PO48.16g,用蒸馏水溶解后定容到1000ml。

2х10-5mol/L,赤霉素溶液：将6.8mg赤霉素溶于少量95%乙酸中，加蒸馏水定容至100ml,浓度即为2х10-5mol/L.然后稀释成2х10-6mol/L， 2х10-7mol/L,2х10-8mol/L.

0.5mmol/L醋酸缓冲液（PH4.8）：每毫升缓冲液中含有链霉素1mg。

I2-KI溶液：0.6g和0.06gI2溶于1000ml 0.05mol/LHCL中。

五、实验步聚

（一）制作标准曲线

1．以淀粉磷酸盐溶液（含淀粉1000μg/L）为母液，用蒸馏水将其稀释成0μg/L,10μg/L,50μg/L,100μg/L,150μg/L,200μg/L,250μg/L,300μg/L,350μg/L的淀粉磷酸盐溶液。

2．取9支试管分别加入上述不同浓度的淀粉磷酸盐溶液各2ml。然后加I2-KI溶液2ml和蒸馏水5ml,充分摇匀。

3．在580nm波长处比色，以0浓度作空白校正仪器零点，准确读出各浓度的吸光度值。

4．以淀粉的不同浓度为横坐标，以吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线。

（二）材料培养

1．选取大小一致的大麦种子50粒，用刀片将每粒种子横切为二，使之成无胚和有胚各半粒。

2．将无胚和有胚的半粒种子分别置于新配制的1%氯酸钠溶液中消毒15min,取出用无菌水冲洗数次，备用。

（三）淀粉酶的诱导

1，取6个青霉素小瓶，编号。

2．按表7-2加入各种溶液及材料：各瓶中混合液的赤霉素浓度分别为0mmol/L,0 mmol/L, 2х10-2mmol/L,2х10-3 mmol/L,2х10-4 mmol/L,2х10-5 mmol/L,醋酸缓冲液为0.5 mmol/L。

（四）淀粉酶活性测定

1．从上述每个小瓶中吸取培养液0.2ml,代分别加入事先盛有1.8ml淀粉磷酸盐溶液（含淀粉身碎骨1000μg/L）的试管中，摇匀，在30摄氏度恒温箱中保温10min.

2．每一试管中加I2-KI溶液2ml和蒸馏水5ml,，并充分摇匀。

3．在580nm波长下进行比色，测定其吸光度，调整仪器零点的溶液应与标准曲线相同。准确读出各溶液的吸光度值，然后由标准曲线查得各溶液中淀粉的含量。

4．以单位体积酶液单位时间内所分解的淀粉量来表示淀粉酶活性（mg/ml/min）.

六、实验结果

以赤霉素浓度的对数为横坐标，ａ-淀粉酶活性为纵坐标作图，分析赤霉素浓度与ａ-淀粉酶活性之间的关系。

七、注意事项

横切种子时，一定要使无胚的一半完全无胚，以免因胚的存在使结果出现偏差。

八、问题讨论

根据本实验的结果，分析不同浓度的赤霉素对ａ-淀粉酶合成的诱导作用。下载本文