320国道起点为上海，终点为云南瑞丽姐告口岸，全程约3695千米。
从上海出发，途经浙江嘉兴、杭州、金华、衢州等地，在浙江境内，它串起多个经济发达且风景秀丽的城市，连接起长三角地区的重要节点。进入江西后，经过上饶、鹰潭、南昌、宜春等城市，为江西的交通和经济发展提供支撑。
接着进入湖南，路过醴陵、株洲、湘潭、娄底、邵阳、怀化等城市，对湖南的区域交流和经济发展意义重大。在贵州，320国道经过玉屏、凯里、麻江、贵定、龙里、贵阳、清镇、平坝、安顺、镇宁、关岭、晴隆、普安、盘州等地，促进了贵州不同区域间的联系。
最后进入云南，途径富源、沾益、曲靖、马龙、嵩明、昆明、安宁、楚雄、南华、祥云、大理、永平、保山、潞西，最终抵达瑞丽姐告口岸。这条国道不仅是一条交通大动脉，还对沿线各地的经济、文化交流与发展起到了重要的推动作用 。
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