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B.自然科学项目√

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（限300字）

蛋白激酶A（protein kinase A, PKA)在疼痛的发生和发展过程中有重要的生理和病理意义，但是在底物水平，对PKA复杂功能的探讨仍缺乏深入的研究。本课题在已有工作的基础上，深入分析PKA的底物Src-suppressed C kinase substrate（SSeCKS）在疼痛模型中的功能。课题首先在整体水平，分析SSeCKS与疼痛病理过程的时空相关性。接着在细胞水平，研究SSeCKS在PKA疼痛信号传导通路中的作用。再从蛋白质相互作用的角度，进一步探讨SSeCKS及其相关分子在正常神经系统以及疼痛发展过程中复杂的蛋白质分子网络作用。课题从PKA底物水平的新角度，研究PKA在疼痛模型中的复杂功能，为疼痛防治提供新的思路，具有一定的理论和实践意义。

疼痛是一种与组织损伤或者潜在组织损伤相关的不愉快的主观感觉和情感体验以及保护性或病理性反应[1]。在疼痛的发生和发展过程中伴随着一系列的行为学改变，如缩回反射、逃避、保持损伤部位不动以及避免与相似的伤害性刺激接触等，以防止伤害性刺激对机体的进一步损害；同时伴随有中枢以及周围神经系统的疼痛相关因子的分泌改变，最近一些文章报道一些炎性介质如前列腺素E2(prostaglandin E2), 5-羟色胺(serotonin), 肾上腺素(epinephrine), 和神经生长因子（nerve growth factor）, 通过初级传入神经元中的蛋白激酶A（protein kinase A, PKA),蛋白激酶C （protein kinase C , PKC), 或者细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinases, ERKs) 的活化，从而产生痛觉过敏反应 [2-4]。

蛋白激酶A，又称依赖于cAMP的蛋白激酶A(cyclic-AMP dependent protein kinase A)， cAMP的功能是作为一种细胞内第二信使传递细胞外的信号，比如荷尔蒙和神经递质，到达细胞内环境中。PKA是其主要靶蛋白，PKA是一种由四个亚基组成的四聚体，其中两个是调节亚基(regulatory subunit,简称R亚基)，另两个是催化亚基(catalytic subunit,简称C亚基)。当cAMP与R亚基结合后，C亚基分离，后磷酸化其底物。cAMP/PKA信号通路调节很多的细胞进程，包括细胞的增殖、分化、肌动蛋白骨架重构以及基因转录。在神经元中，作为丝氨酸和苏氨酸激酶，PKA在生理和病理状态下，都可以被表达增加的cAMP活化。很多研究已经证明PKA的活性在调节感受伤害性行为学中起着一定的作用[5]。但迄今为止，在PKA底物水平，对PKA信号途径所介导的影响疼痛发生和发展的机制仍缺乏深入的研究。

SSeCKS（Src-suppressed C kinase substrate，SSeCKS）为PKC的重要底物，由于其基因的转录被原癌基因src所抑制，其编码产物是PKC的底物，故命名为SSeCKS。SSeCKS全长cDNA有5055bp的开放阅读框，编码含1684个氨基酸残基的多肽链，分子量为280/290 kDa。在第279-7个氨基酸残基之间，有4个PKC的磷酸化位点。SSeCKS人类同源蛋白质是Gravin，分子量为250 kDa，是重症肌无力患者体内的一种自身抗原，也是PKA锚定蛋白家族中的成员（A-kinase anchoring proteins，AKAPs)之一，故又名为AKAP12。SSeCKS作为细胞骨架蛋白，主要通过辅助信号转导相关分子在时间和空间上的协调，而允许特定信号转导和反馈控制。SSeCKS主要锚定于如PKA、PKC、钙调蛋白、细胞周期蛋白等重要信号调节分子，从而控制细胞、分泌和迁移等运动[6]。在神经系统的研究中，主要发现SSeCKS：（1）其人类同源物Gravin参与神经元的分化[7]；（2）与脑发育有关[8]。（3）在感觉神经元中有表达[9]；（4）在星形胶质细胞中也有表达，并在血-脑屏障和血-视网膜屏障的形成和功能维持中有重要功能[10，11]；（5）大鼠脊髓损伤后，在前、后角的神经元，白质中的星形胶质细胞中的表达明显增加[12]。有关SSeCKS在疼痛发生发展过程中的意义还缺乏系统、深入的研究。

Tatsuro等人证明，在活体，鞘内注射缓激态引起热痛觉过敏，这种痛行为学可以被PKC和PKA的抑制剂所阻滞[13]。PKA的抑制剂能完全取消缓激态增强的异硫氰酸丙烯基酯(AITC, allyl isothiocyanate)激发的电流，而且PKA的激活剂可以激活此电流，表明PKA信号通路在瞬时受体电位通道A1(transient receptor potential channel A1,TRPA1)的疼痛致敏机制中起着重要的作用[14]。在小鼠DRG神经元，AKAP150是一个主要的PKA锚定蛋白，参与了PGE2/PKA依赖的TRPV1瞬时受体电位香草醛亚家族1（transient receptor potential vanilloid 1,TRPV1）表达的调节。Sandra等报道，SSeCKS表达在背根神经节和脊髓后角，并且与P物质，降钙素基因相关肽，酸性磷酸酯酶等疼痛相关分子存在一定的共定位[9]。SSeCKS是否参与疼痛信号的传导？与疼痛传导的信号传导途径有什么关系？

蛋白质之间相互作用的研究，是功能基因组的重要组成部分。Wassler [15]证实SSeCKS与β1,4-半乳糖基转移酶 I（β1,4 galactosyltransferase I，GalT-I）相互作用：SSeCKS有两个区域结合GalT-I，调节GalT-I在高尔基体和细胞表面之间的转移。GalT-I是目前发现唯一的既能在细胞膜上发挥重要的细胞粘附作用、又能在高尔基体上参与糖链合成的糖基转移酶。本课题组已证明，GalT-I在神经系统发育与再生，胶质细胞活化与炎症反应中发挥重要作用[16-18]。那么SSeCKS影响GalT-I的功能在疼痛发生和发展过程中的意义，是值得进一步探讨的。

最近，有课题组通过酵母双杂交发现一种热休克蛋白（heat shock proteins ，HSP) HspA12B能与SSeCKS相互作用[19]。HSP是在细胞中丰富表达、种族进化中高度保守与应激反应相关的一组蛋白。HSP70是其中最大的一个家族，HspA12是HSP70s的亚家族，有HspA12A和 HspA12B这两个成员。HspA12B能够调节内皮细胞的迁移和粘附[19]，而SSeCKS能抑制血管发生和促进血脑屏障紧密连接的形成[10]。也有报道显示SSeCKS在亚融合状态表达很强，在融合状态表达较弱[20]，HspA12B的表达模式正好相反[19]。HspA12B在脑发育中的表达模式与SSeCKS惊人一致[8,19]。那么，HspA12B与SSeCKS相互作用，在疼痛的发生和发展过程中又有什么意义？

综上所述，作为PKA的重要底物，细胞骨架蛋白SSeCKS与神经系统的结构和功能关系密切，但在疼痛模型中的作用和意义还缺乏系统、深入的研究。本申请课题拟从疼痛的发生和发展过程，深入研究SSeCKS及其相互作用分子在疼痛模型中的生理与病理意义。

参考文献

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3. Khasar SG, Lin YH, Martin A, Dadgar J, McMahon T, Wang D, Hundle B, Aley KO, Isenberg W, McCarter G, Green PG, Hodge CW, Levine JD, Messing RO (1999) A novel nociceptor signaling pathway revealed in protein kinase C _ mutant mice. Neuron 24:253–260.

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5.  Wu, J., Su, G., Ma, L., Zhang, X., Lei, Y., Lin, Q., Nauta, H.J., Li, J., Fang, L.,.The role of c-AMP-dependent protein kinase in spinal cord and post synaptic dorsal column neurons in a rat model of visceral pain. Neurochemistry international. 2007 50, 710-718.

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13. Kohno, T., Wang, H., Amaya, F., Brenner, G.J., Cheng, J.K., Ji, R.R., Woolf, C.J., Bradykinin enhances AMPA and NMDA receptor activity in spinal cord dorsal horn neurons by activating multiple kinases to produce pain hypersensitivity. J Neurosci. 2008 April 28(17): 4533-4540.

14. Wang, S.,Dai,Y., Fukuoka. T., Yamanaka, H., Kobayashi, K., Obata, K., Cui, X., Tominaga, M., Noguchi1 K.,. Phospholipase C and protein kinase A mediate bradykinin sensitization of TRPA1: a molecular mechanism of inflammatory pain. Brain. 2008 131,1241-1251.

15. Wassler MJ, Foote CI, Gelman IH, et al. Functional interaction between the SSeCKS scaffolding protein and the cytoplasmic domain of beta1,4-galactosyltransferase. J Cell Sci. 2001;114:2291-300.

16. Yan M, Xia C, Niu S, et al. The Role of TNF-alpha and its Receptors in the Production of beta-1,4-galactosyltransferase I mRNA by Rat Primary Type-2 Astrocytes. Cell Mol Neurobiol. 2008; 28:223-36.

17. Yan M, Xia C, Niu S, et al. The role of TNF-alpha and its receptors in the production of beta-1,4 galactosyltransferase I and V mRNAs by rat primary astrocytes.J Mol Neurosci. 2007; 33:155-62.

18. Shen A, Yan J, Ding F, Gu X, Zhu D, Gu J. Overexpression of beta-1,4-galactosyltransferase I in rat Schwann cells promotes the growth of co-cultured dorsal root ganglia. Neurosci Lett. 2003;342:159-62.

19. Rebecca J, Steagall AE, Rusiñol QA et al. HSPA12B is predominantly expressed in endothelial cells and required for angiogenesis. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 2006; 26;2012-2018.

20. Grove BD, Bruchey AK. Intracellular distribution of gravin, a PKA and PKC binding protein, in vascular endothelial cells. J Vasc Res. 2001; 38:163–175

2.1 研究目标：

2.1.1  明确SSeCKS与CCI损伤，以及疼痛发生、发展的时空相关性；

2.1.2  明确SSeCKS与其相关分子的相互作用在疼痛发生和发展过程中的意义。

2.1.3  明确SSeCKS在PKA介导的疼痛传导通路中所起的作用。

2.2 研究内容：

2.2.1在整体模型水平，通过构建CCI等疼痛模型，分析CCI病程中SSeCKS的表达的时空变化，讨论SSeCKS与疼痛生物学行为的可能相关性；在整体模型中干预SSeCKS表达，对比干预前后各种指标，进一步探讨SSeCKS在其中可能发挥的作用。

2.2.2在细胞培养水平，研究SSeCKS的表达与在去除胞体的原代背根神经节的刺激作用下星形胶质细胞生物行为改变，以及合成和释放细胞因子之间的关系。

2.2.3在分子水平，利用分子生物学手段以及SSeCKS自身的生化结构，构建SSeCKS的RNAi片断，以及SSeCKS全长表达质粒，分析SSeCKS影响星形胶质细胞生物学功能的机制，以及与PKA信号途径之间的关系。

2.2.4从蛋白质之间相互作用的角度，研究GalT-I、HspA12B等SSeCKS相关分子，通过与SSeCKS相互作用，在CCI等疼痛模型中的作用，进一步研究SSeCKS及其相关分子在疼痛发生发展过程中复杂的蛋白质分子网络作用。

2.3 拟解决的科学问题

  阐明SSeCKS与疼痛的关系及其参与的分子机制，明确SSeCKS的表达在CCI等疼痛模型中的作用。

3.1 利用CCI等疼痛模型，阐明SSeCKS时空表达与疼痛的发生发展的相关性，以及这种相关性与PKA功能之间的关系。

3.1.1建立大鼠CCI等疼痛模型。运用Real-time PCR、原位杂交、Western Blotting、免疫组织化学等方法，分析疼痛发生发展过程中SSeCKS的表达的时空变化；

3.1.2运用免疫荧光双标技术等分析SSeCKS的细胞定位及其与疼痛相关分子的关系；

3.1.3应用小干扰RNA技术整体干预SSeCKS表达，分别检测上述模型中SSeCKS干预前后相关损伤和疾病变化情况，星形胶质细胞参数改变情况，探讨SSeCKS在疼痛发生发展过程中的作用。

3.2在细胞培养水平中，分析SSeCKS的表达与在去除胞体的背根神经节的刺激下星形胶质细胞生物学行为改变，以及合成和释放细胞因子等之间的关系，以及这些关系与PKA功能之间的相关性。

3.2.1刺激分离、纯化的大鼠脊髓星形胶质细胞 。明确SSeCKS在刺激下的星形胶质细胞中表达的改变，分析这些改变与细胞骨架改变以及炎症因子合成、释放等生物学行为之间的关系。利用PKA的抑制剂和激动剂进行干预，分析这些关系与PKA功能的相关性；干预SSeCKS表达对分化的影响。分析这些变化和影响与PKA功能的相关性。

3.3在分子水平，利用分子生物学手段干预SSeCKS的表达，探讨SSeCKS影响上述细胞生物学功能的作用机制和可能的信号途径。

3.3.1   利用分子生物学手段，以及SSeCKS自身的生化结构，构建或合成SSeCKS不同全长表达质粒、RNAi片断，干预星形胶质细胞中的表达。分析不同SSeCKS水平对星形胶质细胞在刺激下生物功能改变的影响。

3.3.2干预SSeCKS在脊髓星形胶质细胞的表达，联合不同类型PKA及其信号途径的抑制剂和激动剂，分析影响SSeCKS影响星形胶质细胞功能的机制和可能存在的PKA及其它信号途径。

3.4  分析SSeCKS与其相关分子HSP70等相互作用，在疼痛发生和发展过程中的意义。

3.3.3应用蛋白质免疫共沉淀、免疫荧光双标记和激光共聚焦分析方法，分析SSeCKS与其相关分子HSP70等在上述疼痛模型中不同时期时空表达的相关性。

3.3.4分析SSeCKS与其相关分子HSP70等在脊髓星形胶质细胞受到各种刺激后的相互作用情况。

3.3.5利用分子生物学手段，干预SSeCKS相关分子HSP70等表达，分析干预后对脊髓星形胶质细胞生物学行为的影响，及与SSeCKS的相关性。

3.3.6干预SSeCKS相关分子HSP70等在脊髓星形胶质细胞的表达，分析其与SSeCKS相互作用的上、下游关系，和可能的作用机制和信号途径。

3.5  根据以上结果，综合分析SSeCKS在疼痛发生发展过程中的意义。

3.6  技术路线

3.7  创新性

3.7.1  本课题从整体动物模型、细胞培养和分子干预等不同水平，全方位立体分析SSeCKS        在疼痛发生发展过程中的意义。从PKA底物水平的新角度，分析PKA信号途径所介导的影响脊髓星形胶质细胞生物学行为的机制。

3.7.2本课题将神经生物学、免疫学和蛋白质组系在一起，发挥了学科交叉的作用。项目的完成将进一步阐明有关疼痛发生发展的机制，为有关疼痛防治提供新的思路，具有一定的理论和实践意义。研究所得的结果争取在国际SCI 收录的期刊上发表。

3.8     可行性分析

3.8.1课题组和其他研究小组已证明，SSeCKS在炎症过程中有重要作用。

3.8.2在研究过程中，已成功构建或合成SSeCKS的表达质粒、RNAi片断，以及SSeCKS全长表达质粒。

3.8.3我们多年从事疼痛研究，成功建立炎症刺激以及疼痛等经典的整体动物模型，建立各种神经元的分离培养技术

3.8.4课题组已建立成熟的基因克隆、突变和表达技术，反义核苷酸和RNAi技术；Western Blot、免疫共沉淀、免疫组化和激光共聚焦等蛋白质分析技术；Real-Time PCR、Northern Blot、原位杂交等核酸研究技术。

    敬请参考立项依据中的有关参考文献和工作基础的课题组已发表相关论文和已开展的工作情况。

2007.09-2008.02  利用CCI疼痛模型，阐明SSeCKS时空表达与疼痛发生发展过程的相关性，以及这种相关性与星形胶质细胞的生物学行为和PKA功能之间的关系。

2008.03-2008.12   分析SSeCKS的表达在各种刺激因素作用下对脊髓星形胶质细胞生物学行为的影响，以及这些关系与PKA功能之间的相关性。利用分子生物学手段分别干预星形胶质细胞中SSeCKS的表达，探讨SSeCKS影响上述细胞生物学功能的作用机制和可能的信号途径。

2008.12-2009.06   分析SSeCKS与其相关分子HSP70等相互作用，在疼痛发生发展过程中的意义。

2009.06-2009.09   课题总结，综合分析SSeCKS在疼痛发生发展过程中的意义。

根据实验进度，作适当调整。

本申请课题在课题组已有工作的基础上，深入分析SSeCKS在疼痛发生发展过程中的意义，在PKA底物水平，研究PKA信号途径所介导的影响脊髓星形胶质细胞生物学行为的机制。课题首先在整体水平，明确SSeCKS与疼痛发生、发展的时空相关性。接着在细胞水平，阐明SSeCKS与脊髓星形胶质细胞与损伤之间的关系。再从蛋白质相互作用的角度，进一步明确SSeCKS及其相关分子在疼痛发展过程中复杂的蛋白质分子网络作用。最后，综合分析SSeCKS在疼痛发生发展过程中的意义，及其与PKA功能之间的关系。

研究结果以论文形式表示，在SCI收录期刊上发表的原创性论文1-2篇。

1.申请人所在的免疫实验室已接收和发表与SSeCKS相关的文章已有8篇：

1. Yan M, Cheng C, Jiang J, Liu Y, Gao Y, Guo Z, Liu H, Shen A. Essential role of SRC suppressed C kinase substrates in schwann cells adhesion, spreading and migration. Neurochem Res. 2009 May;34(5):1002-10. 

2．Liu H, Huang X, Wang H, Shen A, Cheng C. Dexamethasone inhibits proliferation and stimulates SSeCKS expression in C6 rat glioma cell line. Brain Res. 2009 Apr 10;1265:1-12.

3.Chen L, Qin J, Cheng C, et al. Developmental regulation of SSeCKS expression in rat brain. J Mol Neurosci. 2007;32:9-15.

4.Xiao F, Fei M, Cheng C, et al. Spatiotemporal Patterns of SSeCKS Expression After Rat Spinal Cord Injury. Neurochem Res. 2008 Sep;33(9):1735-48.

5. Chen L, Qin J, Cheng C, et al. Spatiotemporal expression of SSeCKS in rat injured sciatic nerve. Anat Rec(Hoboken). 2008 May;291(5):527-37.

6. Cheng C, Liu H, Ge H, et al. Lipopolysaccharide induces expression of SSeCKS in rat lung microvascular endothelial cell. Mol Cell Biochem. 2007;305:1-8. 

7. Cheng C, Liu H, Ge H, et al. Essential role of Src suppressed C kinase substrates in endothelial cell adhesion and spreading.Biochem Biophys Res Commun. 2007;358:342-8. 

8. Sun LL, Cheng C, Liu HO, et al. Src suppressed C kinase substrate regulates the lipopolysaccharide-induced TNF-alpha biosynthesis in rat astrocytes. J Mol Neurosci. 2007;32:16-24.

9. Sun LL, Cheng C, Liu HO, et al. Changes of Src-suppressed C kinase substrate expression in cytokine induced reactive C6 glioma cells. Neurosci Bull. 2007;23:101-6.

10.Yan M, Xia C, Cheng C, et al. The role of TNF-alpha and its receptors in the production of Src-suppressed C kinase substrate by rat primary type-2 astrocytes. Brain Res. 2007;1184:28-37.

本人所作预实验结果：

图1，CCI术后大鼠术侧后爪热痛觉过敏和机械性触诱发痛敏感性增高。

图2，CCI术后SSeCKS在脊髓中的表达情况。A图为蛋白水平，B图为mRNA水平。

图3，CCI模型后，脊髓后角双侧SSeCKS的表达表现出显著的差别，术侧明显高于对侧。

图4，CCI模型后，术侧脊髓后角SSeCKS的细胞定位。

图5，原代培养脊髓星型胶质细胞在去除胞体的背根神经节的刺激后，SSeCKS以及相关炎症因子的表达水平升高。

图6，SSeCKS的miRNA降低了去除胞体的背根神经节刺激星型胶质细胞引起的炎症因子的升高。

图7，SSeCKS的miRNA降低了去除胞体的背根神经节刺激星型胶质细胞引起的p-ERK的升高（A、B）。p-ERK的抑制剂不能影响SSeCKS的表达(C、D)。

2. 所在的免疫学研究室具有成熟、完整的相关研究的细胞生物学、分子生物学技术平台，拥有热敏仪、凝胶图象分析 系统、光学显微镜、荧光显微镜、普通PCR仪、Real-Time PCR仪、超声波细胞粉碎机、冷冻离心机、恒温振荡器、CO2细胞培养箱、酶标仪、核酸蛋白定量仪、BIO-RAD蛋白电泳仪等实验设备。本研究中可能用到的流式细胞仪、激光共聚焦显微镜等借助于本校神经生物学研究所。

3. 本实验室建立成熟的基因克隆、突变和表达技术，反义核苷酸和RNAi技术；Western Blot、酵母双杂交、免疫共沉淀、免疫组化和激光共聚焦等蛋白质分析技术；Real-Time PCR、Northern Blot、原位杂交等核酸研究技术。

    申请人保证上述内容的真实性。如获资助，保证遵守“南通大学研究生科研创新计划”项目实施与管理办法。

                                                   申请人签名 ： 

                                                      年    月    日  

指导教师签名 ：

                                                               年    月    日

                                       学科负责人签名：

                                                               年    月    日

（学院盖章）

年    月    日