生命科学学院课程论文(作业)封面

（ 2015至2016 学年度 第  2  学期）

课 程 名 称：基因工程制药

课 程 编 号：09600088Z  

             学 生 姓 名：**       

学       号：A********  

班       级：制药1301   

             任 课 教 师: ***     

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贝伐珠单抗在肿瘤治疗中的应用

李超

（东北农业大学，生命科学学院）

摘要：贝伐珠单抗是一种重组人源化免疫球蛋白 G1 单克隆抗体，可通过抑制血管内皮生长因子（VEGF）活性及抗血管生成，达到抑制肿瘤生长的目的，目前已广泛用于结直肠癌、肺癌、卵巢癌等多种肿瘤的治疗，尤其是通过与基础化疗结合，能显著提高治疗的有效率以及延长肿瘤患者的无进展生存期和总生存期。本文主要介绍贝伐珠单抗制备原理过程，治疗肿瘤的机制，及该类药物未来的发展。

关键词：贝伐珠单抗；制备过程；VEGF；抗肿瘤

1.引言

癌症是威胁人类健康的主要疾病之一， 预防和治疗癌症也是研究和开发抗体药物的主要目标之一。目前在临床中使用的肿瘤治疗药物多数存在“敌我不分”的问题，即在杀死肿瘤细胞的同时，也破坏了人体正常细胞。 “生物导弹”为解决这个难题提供了一个理想的思路。这种药物经由静脉注入人体内，药效分子集中作用于肿瘤细胞，既增强疗效又减少对机体的毒副作用。单克隆抗体由于具有良好的均一性和高度的特异性，因而在癌症治疗领域中得到了广泛应用。 结直肠癌是常见的消化道恶性肿瘤之一。我国结直肠癌在男女常见的恶性肿瘤中分别排名第 5 和第 6，结直肠癌导致的死亡占所有肿瘤的 5.6％。近年来，随着单抗药物的开发，抗血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)药物在抗肿瘤领域的有效应用，使结直肠癌患者死亡率显著降低。 贝伐珠单抗是罗氏的重磅治疗转移性结直肠癌的药物，属于人源化抗-VEGF单克隆抗体。贝伐珠单抗于2004年获美国FDA批准上市，商品名为“阿瓦斯汀”。其治疗直肠癌的机理是通过与血管内皮生长因子(VEGF)特异性结合，阻止其与受体相互作用，发挥对肿瘤血管的多种作用，使现有的肿瘤血管退化，从而切断肿瘤细胞生长所需氧气及其他营养物质，并可提高化疗药物的效果。在2015年全球十大畅销药物排行中，贝伐株单抗排名第6位，销售额达72.79亿美金。我国的抗体药物产业尚处起步阶段，虽然近10年间国内先后涌现出中信国健、百泰生物等多家专门从事单抗药物生产的企业，并且同时许多传统制药企业也加入到抗体药物领域中来，但总体而言，我国抗体行业普遍存在着细胞系表达水平低、培养规模小、纯化能力不够等技术问题，了我国抗体药物产业的产能规模，制约了行业的发展进程。贝伐珠单抗的未来还是很有市场前景。

2.设计原理

2.1血管生成与贝伐珠单抗的抗肿瘤作用机制

肿瘤依赖周围组织的血管来获取血液供应，以不断地成长和扩散。研究发现，在直径超过 100 ～ 200 μm的肿瘤生长过程中，血管的形成发挥了至关重要的作用，而异常的血管生成过程，导致肿瘤组织的脉管系统呈现结构紊乱、血供差、血管通透性增加等特点，这些特点又致使恶性肿瘤对细胞毒性化疗药物的利用效能降低，并增加了转移的风险[2]。血管生成是一个极其复杂的过程，需要脉管系统、循环内皮细胞以及包括VEGF在内的促血管生成介质的参与。其中，VEGF/VEGFR 是一条重要的信号传导途径，VEGF 通过与组织上皮细胞中表达的 VEGFR-l 和VEGFR-2 相结合，激活细胞内的信号传导途径，导致血管内皮细胞增殖及新生血管形成[3]（又见：Borgstr?m 等, Anticancer Res, 1999年）。VEGF的表达与恶性肿瘤的进展、期别、腹水形成、无瘤生存时间缩短及总体预后差有关[4]。免疫组化检查发现，VEGF 在肿瘤及其转移组织中均有表达，且在恶性腹水和血清中可检测到。而在肿瘤患者体内所检测到的VEGF和VEGFR表达是的预后因素（Borgstr?m等, Cancer Res, 1996年）。更重要的是，VEGF的表达具有肿瘤特异性，其在恶性肿瘤中高表达，在交界性肿瘤中中等强度表达，而在正常组织中几乎不表达。此外，由VEGF介导的新生血管因基底膜存在间隙，使得肿瘤细胞易于扩散。因此，VEGF 被认为在肿瘤生长、腹水形成和肿瘤转移中发挥着重要作用，针对血管形成的靶向治疗在肿瘤治疗中的作用日益受到重视。贝伐珠单抗作为一种重组人单克隆抗体，是目前被研究最多的抗血管生成药物，其作用机制是，通过与VEGF 结合，从而阻止 VEGF 与其自然受体——VEGFR结合，抑制血管内皮细胞增殖和活化，从而发挥抗血管生成和抗肿瘤作用。此外，按照 Jain 提出的有悖于传统的设想（Jain, Nat Med, 2001 年），抑制 VEGF，将重启促血管生成和抗血管形成的平衡，导致扭曲异常的肿瘤组织结构、功能及其微环境和脉管系统趋于正常化，从而促进化疗药物的吸收，并减少肿瘤转移的机会[3-8]（又见：Borgstr?m等, Cancer Res, 2012年）。

2.2 贝伐珠单抗在肿瘤治疗中的应用

2.2.1 用于结直肠癌

近年来，化疗联合抗血管生成治疗的应用，使转移性结直肠癌（mCRC）患者的死亡率显著降低。多项Ⅱ / Ⅲ期临床研究均显示，贝伐珠单抗联合化疗，可显著提高治疗效果。Hurwitz 等[10]将 813 例进展期结直肠癌患者随机分成两组，采用 5- 氟尿嘧啶（5-FU）+ 亚叶酸钙 +伊立替康联合或不联合贝伐珠单抗进行治疗，结果显示，化疗联合贝伐珠单抗组受试者的总生存期 (overall survival，OS) 较单纯化疗组明显延长（20.3个月 vs 15.6个月，HR=0.66，P<0.001），而两组的无进展生存期 (progression-free survival，PFS) 分别为 10.6 个月和 6.2个月，客观反应率 (objective response rate, ORR) 分别为44.8％和 34.8％，差异有统计学意义，说明联合贝伐珠单抗的化疗方案更加有效。

贝伐珠单抗的出现与使用，在原化疗的基础上，可显著延长 CRC 患者的 OS 和 PFS，且其联合伊立替康或奥沙利铂为基础的化疗，均能产生显著疗效；其在一线治疗失败后继续使用仍有机会获益，这在临床上为mCRC 的治疗提供了新的跨线治疗模式。当然，在贝伐珠单抗的使用过程中，常见不良反应如高血压等也需密切观察和必要的干预。

2.2.2 用于多形性胶质母细胞瘤 

多形性胶质母细胞瘤 (glioblastoma，GBM) 是恶性胶质瘤的一种，是高度血管化的肿瘤。VEGF 在胶质瘤及其周围组织中均有表达，并且随着肿瘤恶性程度的增高而上调，但在正常脑组织中几乎不表达，且VEGF介导的新生血管生成与胶质瘤侵袭性、恶性程度及治疗失败等密切相关[18-19]。作为 VEGF 抑制剂，贝伐珠单抗被认为可以抑制GBM的进展。

2.2.3 用于新诊断的多形性胶质母细胞瘤   

贝伐珠单抗同样被证实可用于治疗新诊断的 GBM 患者。一项名为AVAglio的临床研究中，921例新诊断的GBM患者分成两组，分别接受放疗、替莫唑胺联合或不联合贝伐珠单抗治疗。结果显示，与不联合贝伐珠单抗组相比，联合贝伐珠单抗组受试者的 PFS 显著延长 4.4 个月（10.6 个月 vs 6.2个月，P<0.001）, 进展或死亡风险降低36%，副作用与已知的贝伐珠单抗副作用一致。表明，贝伐珠单抗用于新诊断的 GBM 患者，同样具有较好的疗效和安全性[24-25]。GBM患者的标准疗法为手术切除及同步放化疗，但预后一直很不理想，复发几乎很难避免，5年总生存率不足10%，这一疾病的治疗一直是临床工作的难点[26-27]。贝伐珠单抗的出现，为这一疾病的治疗带来了新的治疗模式和希望。目前，贝伐珠单抗用于 GBM 的治疗，尚处起步阶段，世界范围内的应用还仅局限于复发性GBM 患者，不过日本已批准贝伐珠单抗用于新诊断的GBM 患者。此外，贝伐珠单抗用于 GBM 的远期疗效、联合用药及治疗时机等问题，仍有待进一步研究。

3技术路线

3.1贝伐株单抗的研究进展 

贝伐单抗是抗 VEGF 的人源化单抗 ,主要通过中和 VEGF 来阻断其与内皮细胞上的受体结合 ,使得肿瘤细胞不能得到养分和氧 ,起到治疗肿瘤的作用。Presta 等将鼠抗人VEGF单克隆抗体(muMAB VEGF) A. 4. 6. 1 的互补决定区与人 IgG 1的恒定区框架嵌合 ,并对相应氨基酸残基加以修饰 ,最终形成了人鼠嵌合型 VEGF 单抗 ,仍然有 7 %的氨基酸来源于鼠抗体。实验表明 ,贝伐单抗用于治疗肿瘤安全有效。 贝伐株单抗是 10 年前批准的治疗结肠癌药物，2004 年由 FDA 批准，2005 年获得欧盟批准，在美国的专利有效期为 2019 年，在欧盟的专利有效期为 2022 年。2010 年获得中国 CFDA 批准，并于 2015 年获得肺癌适应症的批准，用于晚期、转移性或复发性非鳞非小细胞肺癌的一线治疗。截至目前，俄罗斯的 Biocad 公司、美国的 Pfizer公司正在进行III期临床实验，德国的Boehringer Ingelheim公司已于7月份启动III期临床，目前正在招募临床实验志愿者。 贝伐株单抗也是一种比较特别的药物，医生们不断地发现了他的新疗效，这也为罗氏赢得了更多的许可和盈利。2012 年 FDA 批准贝伐株单抗为治疗转移性结肠癌的第二线药物，日本批准其为治疗脑癌的第一线药物，贝伐株单抗现在还在进行 6 种治疗方向的临床实验。

3.2制备思想

采用重组 DNA 技术，人工合成贝伐株单克隆抗体重链与轻链基因，将此克隆的重链与轻链基因片段分别插入到自行构建的一种高效逆转录病毒前载体，将获得重链表达前载体和轻链表达前载体分别与病毒包装质粒pHCMV-G共转染包装细胞293GP，制备获得两种分别携带有贝伐株单克隆抗体重链与轻链基因的逆转录病毒载体。两种逆转录病毒载体先后交替转导CHO-S细胞，获得可稳定表达贝伐株单克隆抗体的工程细胞。应用先进的细胞培养技术，经过细胞的扩增培养和发酵表达培养，在哺乳动物细胞表达系统中国仓鼠卵巢细胞中产生贝伐珠单抗，然后采用包括病毒灭活和去除步骤在内的纯化工艺进行纯化，再经过配制、除菌过滤、无菌灌装等制剂生产工艺获得成品。 通过多次实验对细胞培养工艺、纯化工艺及制剂生产工艺的各个工艺参数进行不断的摸索和优化，最终确定了高效表达贝伐株单克隆抗体的生产工艺。

3.3制备方法

3.3.1工程细胞的构建和鉴定 

人工合成贝伐株单克隆抗体重链与轻链基因，DNA 测序分析表明其编码的氨基酸序列与同类上市产品AVASTIN?（安维汀?，贝伐株单抗注射液，罗氏公司）公开的氨基酸序列完全一致。将此克隆的重链与轻链基因片段分别插入到自行构建的一种高效逆转录病毒前载体pCS-new MCS-WPRE（new ori），分别获得重链表达前载体pCS-Hideaway HC-WPRE（new ori）和轻链表达前载体pCS-Hideaway LC-WPRE（new ori）。将 pCS-HideawayHC-WPRE（new ori）和 pCS-HideawayLC-WPRE（new ori）分别与病毒包装质粒 pHCMV-G 共转染包装细胞 293GP，制备获得两种分别携带有贝伐株单克隆抗体重链与轻链基因的逆转录病毒载体。两种逆转录病毒载体先后交替转导CHO-S 细 胞 ，获 得 可 稳 定表达贝伐株单克隆抗体的工程细GCHO-S/sC-Hideaway-LC2/HC3-R，肽图、等电聚焦和生物学活性检测均证实该细胞株。分泌表达的贝伐株单克隆抗体与 AVASTIN?具有结构上的高度一致。有限稀释法挑选单克 隆 ， 经 多 轮 筛 选 得 到 一 株 可 高 水 平 分 泌 表 达 该 蛋 白 的 细 胞 株GCHO-S/sC-Hideaway-LC2/HC3-RB008，在细胞培养瓶中的表达量达1.0mg/ml。实时荧光定量PCR对连续传代30代的细胞进行目的基因拷贝数分析，结果显示经长期传代，各代次细胞中拷贝数水平稳定（重链基因 5.6±0.7 拷贝/细胞，轻链基因 20.3±8.2拷贝/细胞）；基因测序分析结果显示各代次细胞中目的基因序列完全一致，表明目的基 因 稳 定 整 合 在 CHO 细 胞 染 色 体 中 。 以 上 工 作 证 实 了 所 建 立 的GCHO-S/sC-Hideaway-LC2/HC3-R B008 工程细胞株可稳定高水平表达贝伐株单抗，该抗体具有与AVASTIN○R相似的生物学特性。 以GCHO-S/sC-Hideaway-LC2/HC3-R B008细胞株先后建立了主细胞库和工作细胞库，分别命名为 GM-ADL-MCB 和 GM-ADL-WCB。主细胞库、工作细胞库和生产终末细胞按照《中华人民共和国药典》三部通则中“生物制品生产用动物细胞基质制备及检定规程”的规定委托中国食品药品检定研究院和中国典型培养物保藏中心做全面检定，结果合格。

3.3.2 细胞培养

分别选择CD OptiCHO（Invitrogen）、imMEDIAte ADVANTAGETM 60722（SAFC）和CDM4PERMAb（Hyclone）三种CHO无血清培养基，在125ml三角瓶中进行细胞培养，测定细胞密度、细胞存活率及表达量，选择适宜细胞基础培养基。 补料成分的选择，鉴于我公司对 Hyclone 公司的 Cell Boost 系列补料培养基有丰富的使用经验，且该补料培养基为化学成分限定型培养基，成分明确，不含蛋白水解物，培养的产品适合下游纯化，因此，我们对Cell Boost系列补料培养基[15]中常用的Cell Boost2、Cell Boost3和Cell Boost5 的添加工艺进行了研究和优化。

3.3.3 纯化工艺

3.3.3.1Mabselect Sure亲和层析

ProteinA的层析介质是大规模单克隆抗体捕获工艺的业界标准，深层过滤后培养上清上样至亲和层析柱，确定临床前中试生产亲和层析的方案。

3.3.3.2. Q-FF 阴离子交换层析

在单克隆抗体及其片段的分离纯化中，离子交换层析由于其价格相对便宜，使用寿命长，分离条件温和，选择范围广，耐受强酸碱的处理而被广泛应用。样品进一步上样至阴离子交换层析柱，采取流穿的方式收集抗体，最后用高盐和强碱去除吸附在介质上的内毒素和核酸。

3.3.3.3阳离子交换层析  

单克隆抗体纯化过程中，阳离子交换层析常与阴离子交换层析串联使用。我们采用阳离子交换层析的结合-洗脱方式进行最后的精细纯化，确定中试生产层析方案。 阳离子交换层析 pH 值的研究 对于离子交换层析，抗体与层析填料的结合能力随 pH 改变而不同，因此 pH 值的选择至关重要。我们选择 pH5.2、6.0、6.5、7.0 四个不同的 pH 值条件，通过考察载量、纯度及收率确定最佳pH值。层析柱为HiTrap SP FF 1ml预装柱（GE公司），流速1ml/min，0～100%B液进行线性洗脱25倍柱体积。

3.3.4制剂工艺研究

原研药物选择同类上市对照品AVASTIN?，AVASTIN?于2004年首次在美国FDA批准上市，2010 年正式进入中国市场，目前已在全球 83 个国家上市，适应症于转移性结直肠癌安维汀联合以5-氟尿嘧啶为基础的化疗，适用于转移性结直肠癌患者的治疗，十年的临床应用历史证明其具有良好的安全性。在原研药物的制剂配方基础上，设计6个处方，从不同的辅料及辅料浓度综合研究贝伐株单抗注射液制剂的稳定性。

4.预期目标

     综上所述，贝伐珠单抗在针对不同肿瘤及晚期肿瘤治疗的多项临床试验中，均显现出很好的疗效，能显著改善患者的 PFS 或 OS。然而，在某些肿瘤的不同治疗时期，贝伐珠单抗的使用也被证实并无显著疗效。所以，总体来说，贝伐珠单抗对肿瘤的治疗是一个很好的补充，但在临床应用中，应充分考虑患者自身、病情以及治疗情况等3个方面，综合患者的个体化信息，选择贝伐珠单抗治疗的适宜与有效人群，并应考虑用药过程中的不良反应，使患者在这一VEGF抑制剂的临床应用中能够收获最大效益。

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