Trizol : column-based kit, guidelines differ due to different buffers

Clean and free from residual buffers

Main problem: exaction of inhibitors together with the nucleic acids or degradation of sample

            Inhibitor found in blood or environmental samples

General rule: fresh sample, -80 centigrade stored

One-step or two-step reaction?

Total RNA, perform RT before qPCR

One step/two steps: avoid contamination, RNase free, tubes containing the reaction be maintained on ice

30min and 50 centigrade, if random primers/oligo d(T) used(two steps) initial 10 min-step at 25 centigrade to maximize the annealing efficiency as the short oligo d(T) have a lower Tm

Stored -80 centigrade, limiting amount of starting material separate RT step

Back ground?

Which type of primers for the Reverse Transcription?

●Short random primers

●Oligo d(T) bind to the pply-A tail of the RNA ant then transcribe RNA

●Specific primers

One-step qrt-PCR: specific primers, avoid aspecific products

               RT at 40-50 centigrade    specific PCR primers desingned at 60 centigrade

               Partial annealing?

Two-steps qrt-PCR: oligo d(T) or/and random primers in RT step

                Specific primers in PCR step

Qualitative vs. Quantitative PCR

●Taq polymerase , extension of short single-stranded primers

●Repeated cycles of heat de-naturation, primer annealing and primer extension

●Primers, specifically bind to extremities of the DNA fragment to be amplified

Taq polymerase use target DNA as a template for primer extension

Each cycle, more template DNA, exponential manner, doubling, until one of reagents limiting

●Qualitative PCR

●Detection chemistry allows quantification

●Amount at a certain point of the run is related to the initial amount of target in the sample

●Most common applications: gene expression analysis, pathogen detection/quantification and microRNA quantification

●Initially a exponential process, eventually a plateau phase

Assume the amount double each cycle and no bias due to limiting reagents

Analysis: Ct value, the more template sample, the quicker Ct point reached, the cleaner Ct values

●Qualitative PCR

●Detect the presence or absence of a certain sequence

●Virus sub-typing and bacterial species identification, allelic discrimination

Different fluorophores used for alleles, the ratio of fluorophores related to the amount

●Double-Dye probe system?

●HMR(gene scanning, SNP)

Detection methods

●Measurable signal: fluorescent technologies, non-specific and specific

●SYBR® Green I

Most commonly dye, non-specific detection

dsDNA intercalating dye, 520nm, emitted related to amount of target

Running a meltcurve at the end of PCR run for specificity of the system

Rarely used for qualitative PCR, often used as the first step to check the specificity of the primers and validate the design.

●High Resolution Melting dyes (HRM dyes)

Separate nucleir acid based on their dissociation behavior

DsDNA, heated, fluorescent dye

●TaqMan® probes = Double-Dye probes

●LNA® Double-Dye probes

●Molecular Beacon probes

●Scprpions primers

●Hybridization probes

●TaqMan® MGB probe

●MGB Eclipse® probe

When should I multiplex？

●Multiplex and singplex

●SNP/mutation analysis

●Targets  two genes with equal expression levels

●Quantify lots of different targets on few samples

●Strict requirement for the design

How do you get starte d in qPCR?

Thermocycler：format, number of detection channels, software, time of run, price and flexibility

qPCR reagents：Core kits/MasterMixes

Role of components

Taq Polymerase: 95 centigrade – 5-10 min activate, the antibody-blocked Taq and the chemicallyblocked Taq

dNTPS/dUTPS: 下载本文