基因有限公司市场/技术支持部

本文献汇编包括以下内容:

1, 遗传标记简介

2, 分子标记介绍

3, 两种重要的分子标记技术AFLP和SNP及其在植物基因组研究中的应用

4, 有关仪器介绍

1)LI-COR公司的GLOBAL  IR2 系统

2)PYROSEQUENCING公司的PSQ96 DNA系统

一, 遗传标记简介

以下内容摘自:邱芳 伏健民 金德敏 王斌,遗传多样性的分子检测,生物多样性,1998年5月,第6卷,第2期

选读材料:梁明山等,遗传标记及其在作物品种鉴定中的应用,植物学通报,2001年3月,第18卷,第3期

遗传标记(genetic markers)是基因型的特殊的易于识别的表现形式.遗传标记的发展过程主要分为4种类型：（1）形态标记(morphological markers)；（2）细胞标记(cytological markers)；（3）生化标记(biochemical markers)；（4）分子标记(molecular makers)。前3种标记都是基因表达型的标记，可利用的多态位点较少，易受环境影响，不能满足物种资源鉴定的需要。直到1980年美国Botstein提出DNA性酶切片断长度多态性（RFLP）可以作为遗传标记，开创了直接应用DNA多态性发展遗传标记的新阶段。80年代DNA多聚酶链式反应（PCR）技术的出现，又推动产生了许多新型的分子标记如RAPD标记，SSR标记等。1992年由Zebeau和Vos发展起来的扩增片段长度多态性（AFLP）技术被认为是迄今为止最有效的分子标记，既有RFLP的可靠性，又有RAPD的方便性。分子标记的飞速发展促进了真核生物遗传图谱的构建，目前人类和各主要作物的RFLP遗传图谱已基本完成，可以提供基因组各基因间相互作用的全面信息，观察到群体内和群体间由于位点间互作引起的变异分化，在基础理论、遗传育种和物种进化等方面显示出重要应用价值。本文将阐述遗传多样性的主要检测方法，着重讨论分子标记及其在生物多样性研究方面的广泛应用。

                            1　形态标记

　  形态标记是指生物特定的肉眼可见的外部特征特性，如植物的株高、叶形、果实颜色等。从广义上讲形态标记也包括与色素、生殖生理特性、抗病抗虫性等有关的标记。由于简单直观，容易观察记载，长期以来，对物种的分类及资源鉴定都是以形态标记为主要的或初步的指标。由自然突变或物化诱变均可获得具有特定形态特征的材料，但所需时间长，并且可能同时诱变产生不利的重要性状。其缺点是数量较少，遗传表达有时不太稳定，易受环境条件及基因显隐性的影响。

2　细胞学标记

　　显微镜技术的改进，不仅使人类认识到微观世界的生物多样性，并且建立了染色体核型和带型分析技术来鉴别宏观物种的分类及核型演化。核型是指把动植物、真菌等的某一个体或某一分类群的体细胞内整套染色体显微摄影后再放大照片，按照染色体相对长度、臂指数、着丝粒指数、染色体臂数等4个参数将所有染色体作系统排列，可代表一个物种的染色体特征。染色体分带技术是将某物种染色片用不同物化手段处理，再用不同染料染色，在荧光激发下染色体臂会显示出不同的带数，如G带（Giemsa banding），C带（Constitutive heterochromatin banding），N带（Nucleolar organizer region banding）等，可明确鉴别许多物种核型中的任一条染色体，包括小麦黑麦在内的主要作物都有一套标准的染色体分带模式图［1、2］。此外，染色体结构变异如缺失、易位，非整倍体如缺体、单体、三体等都各有其特定的细胞学特征，也可作为一种细胞标记。显然，细胞学标记的数目也很有限。

3　生化标记

　　60年代初出现了同工酶标记。可从蛋白质水平来反映生物的遗传变异。同工酶是指具有同一底物专一性的不同分子形式的酶，具有组织、发育及物种的特异性。其基本原理是根据电荷性质差异，通过蛋白质电泳或色谱技术和专门的染色反应显示出同工酶的不同形式，从而鉴别不同基因型。由于其经济方便，易于操作，受到广泛应用。特别在品种质量和纯度鉴定以及动植物群体遗传结构研究中进行同工酶电泳分析已成为常规操作［3］，但实验结果随动植物不同发育时期、器官及环境而变化，可以利用的遗传位点数量比较小，对电泳分析的样品要求较高。

4　分子标记

　　DNA的多态性是生物多样性的本质内容。为了深入掌握生物多样性的遗传学基础，最理想的办法就是直接观察测定DNA的变异。分子标记即是指以DNA多态性为基础的遗传标记。它具有以下优点：直接以DNA的形式出现，没有上位性效应，不受环境和其他因素的影响；多态性几乎遍及整个基因组；表现为中性标记；不影响目标性状的表达，与不良性状无必然连锁；有许多分子标记为共显性；部分分子标记可分析微量DNA和古化石样品。

二, 分子标记的种类及其发展

以下内容选自:黎裕 贾继增 王天宇, 分子标记的种类及其发展,生物技术通报,1999年 第15卷　第4期　

选读材料:

1,邱芳 伏健民 金德敏 王斌,遗传多样性的分子检测,生物多样性,1998年5月,第6卷,第2期

2,梁明山等,遗传标记及其在作物品种鉴定中的应用,植物学通报,2001年3月,第18卷,第3期

3, Kristensen VN, Kelefiotis D, Kristensen T, Borresen-Dale AL. High-throughput methods for detection of genetic variation. Biotechniques. 2001 Feb;30(2):318-332. 这是一篇关于遗传变异的高通量检测方法和原理的极好的综述.

1　引言

1.1　分子标记概念的界定

　　广义的分子标记(molecular marker)是指可遗传的并可检测的DNA序列或蛋白质。蛋白质标记包括种子贮藏蛋白和同工酶(指由一个以上基因位点编码的酶的不同分子形式)及等位酶(指由同一基因位点的不同等位基因编码的酶的不同分子形式)。狭义的分子标记概念只是指DNA标记，而这个界定现在被广泛采纳。本文中也将分子标记概念限定在DNA标记范畴。

1.2　理想的分子标记的界定

　　理想的分子标记必须达到以下几个要求：(1)具有高的多态性；(2)共显性遗传，即利用分子标记可鉴别二倍体中杂合和纯合基因型；(3)能明确辨别等位基因；(4)遍布整个基因组；(5)除特殊位点的标记外，要求分子标记均匀分布于整个基因组；(6)选择中性(即无基因多效性)；(7)检测手段简单、快速(如实验程序易自动化)；(8)开发成本和使用成本尽量低廉；(9)在实验室内和实验空间重复性好(便于数据交换)。

　　但是，目前发现的任何一种分子标记均不能满足以上所有要求。

2　分子标记的种类

2.1　性片段长度多态性

2.1.1　性片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism,缩写RFLP)是发展最早的分子标记技术。RFLP技术的原理是检测DNA在性内切酶酶切后形成的特定DNA片段的大小。因此凡是可以引起酶切位点变异的突变如点突变(新产生和去除酶切位点)和一段DNA的重新组织(如插入和缺失造成酶切位点间的长度发生变化)等均可导致RFLP的产生。此技术及其从中发展起来的一些变型均包括以下基本步骤：DNA的提取、用性内切酶酶切DNA、用凝胶电泳分开DNA片段、把DNA片段转移到滤膜上、利用放射性标记的探针显示特定的DNA片段(通过Southern杂交)和分析结果。由于线粒体和叶绿体DNA较小，前三个步骤就完全可能检测出DNA片段的差异，所以往往不必要后面的几处步骤；对线粒体和叶绿体DNA进行的这种多态性差异检测在1980年之前就已出现，从理论上说，这种多态性也可称为RFLP。

2.1.2　一般选择单拷贝探针

　　但如果RFLP探针是来自拷贝数可变串联重复(Varible number of tandem repeats,缩写VNTR)，则产生另一类因相同或相近序列的拷贝数变化所引起的多态性。凡是引起复单位的大小和序列不同、基因组中重复的数目和分布不同等均可导致这种多态性的产生。在RFLP技术中有特殊用途(成为分子标记)的重复序列包括：(1)小卫星(minisatellite)序列：重复单位(motif)约有碱基10～60个(也有16～100个碱基一说)，在基因组中多次出现。(2)微卫星(microsatelite)或简单重复序列(simple sepuencerepeats,缩写SSR)：重复单位含有1～5碱基(也有2～8个碱基一说)，(microsatcllite词由Litt & Luty(19))［11］提出。

2.2　以PCR(聚合酶链式反应)为基础的分子标记

2.2.1　随机扩增多态性DNA(random amplified polymorphic DNA,缩写RAPD)

2.2.1.1　基本原理和特点　该技术用一个(有时用两个)随机引物(一般8～10个碱基)非定点地扩增DNA片段，然后用凝胶电泳分开扩增片段。其特点包括：(1)不需DNA探针，设计引物也不需要知道序列信息；(2)用一个引物就可扩增出许多片段(一般一个引物可扩增6～12条片段，但对某些材料可能不能产生扩增产物)，总的来说RAPD在检测多态性时是一种相当快速的方法；(3)技术简单，RAPD分析不涉及Southern杂交、放射自显影或其它技术；(4)不象RFLP分析，RAPD分析只需少量DNA样品；(5)成本较低，因为随机引物可在公司买到，其价格不高；(6)RAPD标记一般是显性遗传(极少数是共显性遗传的)，这样对扩增产物的记录就可记为"有/无"，但这也意味着不能鉴别杂合子和纯合子；(8)RAPD分析中存在的最大问题是重复性不太高，因为在PCR反应中条件的变化会引起一些扩曾产物的改变；但是，如果把条件标准化，还是可以获得重复结果的［12］；(9)由于存在共迁移问题，在不同个体中出现相同分子量的带后，并不能保证这些个体拥有同一条(同源)的片段；同时，在胶上看见的一条带也有可能包含了不同的扩增产物，因为所用的凝胶电泳类型(一般是琼脂糖凝胶电泳)只能分开不同大小的片段，而不能分开有不同碱基序列但有相同大小的片段。

2.2.1.2　RAPD技术的发展和相近的分子标记种类　下面提到的所有技术都是利用一个或两个短的富含GC碱基的随机引物：

　　DAF(DNA amplification fingerprinting):与RAPD技术不同的是，在DAF分析中，引物浓度更高，引物长度更短(一般5～8个碱基)，只有两个温度循环(在RAPD中是三个温度循环)，并且往往用聚丙烯酰胺凝胶电泳，DAF通常会产生非常复杂的带型［5］。在DAF技术的基础上，又发展出了ASAP技术(arbitrary signatures from amplification profiles)［4］。

　　AP-PCR(arbitrarily primed polymerase chain reaction)：在AP-PCR分析中，扩增分为三个部分，每个部分要求的条件和组分的浓度存在差异；在第一个PCR循环中，引物浓度较高；引物长度不定，并且常常来自为其它目的而设计的引物(如M13通用测序引物)［20］。

　　MAAP(Multiple Arbitrary Amplicon Profiling):这是Caetano-Anolles(1994)［3］

创造的一个词，想用来统称所有这些相关技术，但迄今为止这个词很少使用。

2.2.2　特定序列位点

　　特定序列位点(sequence-tagged site,缩写STS)是对由其特定引物序列所界定的一类标记的统称。利用特异PCR技术的最大优点是它产生的信息非常可靠，而不象RAPD、AFLP和利用随机探针产生的RFLP存在某种模糊性(如难以鉴别片段的来源)。这类分子标记主要包括以下几种分子标记。

2.2.2.1　STMS(Sequence-tagged microsatellites)通常又称为SSR，也可称为SSRP(Simple Sequence Repeat Polymorphisms)

2.2.2.1.1　基本原理和特点　引物根据与微卫星重复序列两翼的特定短序列设计，用来扩增重复序列本身。由于重复的长度变化极大，所以这是检测多态性的一种有效方法。其特点包括：一般检测到的是一个单一的多等位基因位点；共显性遗传，故可鉴别杂合子和纯合子；得到的结果复性很高。为了提高分辨力，通常使用聚丙烯酰胺凝胶电泳，它可检测出单拷贝差异。也可以在同一个反应试管中把PCR反应与不同的STMS引物结合起来(称为multiplexing)，这可节省时间，但是，这只能在不同引物的产物在大小上下不重叠的情况下才能使用。很显然使用STMS技术的前提是需要知道重复序列两翼的DNA序列的信息，这一方面可以在其它种的DNA数据库中查询，否则就必须先建立含有微卫星的基因组文库，再从中筛选可用的克隆，进行测序，然后设计合适的引物。

2.2.2.1.2　STMS的发展和相近的分子标记种类

　　(1)把与SSR互补的寡核苷酸作为多位点RFLP技术中的探针；

　　(2)把与SSR互补的寡核苷酸作为PCR引物(可单独作引物或与随机引物配合使用)，扩增的是基因组DNA的特定片段，即MP-PCR［7］和RAMPs［21］；

　　(3)用标记的SSR探针与RAPD扩增片段杂交，即RAMPO［15］或称为RAHM或RAMS；

　　(4)用5′或3′端加锚的SSR作引物(如GG［CA］7)，即ISSR［23］(见2.2.2.2)。

2.2.2.2　加锚微卫星寡核苷酸(Anchored microsatellite oligonucleotides)

　　Zietkiewicz et al.(1994)［23］对STMS技术进行了发展，他们用加锚微卫星寡核苷酸作引物，对基因组节段而不是重复序列本身进行扩增。在SSR的5′端或3′端加上2～4个随机选择的核苷酸，这可引起特点位点退火。这样就能导致位于反向排列的间隔不太大的重复序列间的基因组节段进行PCR扩增。这类标记又被称为ISSR(inter-simple sequence repeat)［23］、ASSR(anchored simple sequence repeats)［17］或AMP-PCR［18］。这类标记往往是显性遗传的。在所用的两翼引物中，可以一个是ASSR引物，另一个是随机引物［17］。如果一个是5′端加锚的ASSR引物，另一个是随机引物，则被称为RAMP技术［21］。

2.2.2.3　SCAR(Sequence-characterized amplified regions)

　　SCAR标记是在RAPD技术的基础上发展起来的［14］。其基本步骤是：先作RAPD分析，然后把目标RAPD片段(如与某目的基因连锁的RAPD片段)进行克隆和测序，根据原RAPD片段两末端的序列设计特定引物(一般比RAPD引物长，通常24个碱基)，再进行PCR特异扩增，这样就可把与原RAPD片段相对应的单一位点鉴定出来。这样的位点就称为SCAR。SCAR比RAPD和其它利用随机引物的方法在基因定位和作图中的应用更好，因为它有更高的可重复性(原因是使用的引物长)，标记是共显性遗传的。

2.2.2.4　CAPS (Cleaved amplified polymorphic sequence)

　　CAPS技术又可称为PCR-RFLP。所用的PCR引物是针对特定的位点而设计的。其基本步骤是：先进行PCR扩增，然后将PCR扩增产物用性内切酶酶切，再用琼脂糖凝胶电泳将DNA片段分开，用EB染色，观察［10］。与RFLP技术一样，CAPS技术检测的多态性其实是酶切片段大小的差异。在酶切前进行RCR产物检测，其多态性称为ALP［6］。Neff et al.(1998)［13］在此基础上又发展出dCARS技术(derived CAPS)，这是检测单核苷酸多态性的一种良好方法。

2.2.2.5　SPAR (single primer amplification reaction)

　　SPAR技术与RAPD技术相似的是也只用一个引物，但SPAR分析中所用的引物不是随机的，而是在SSR的基础上设计的，例如可能的序列是(TA)10或(CGA)6。扩增的是SSR之间的DNA序列［8］。又称为MP-PCR(microsatellite-primed PCR)［19］。

2.2.2.6　DAMD(directed amplification of minisatellite region DNA)

　　直接用小卫星的核心序列作引物进行扩增。

2.2.2.7　Inter-Alu PCR like genomic profiling

　　与SPAR技术相近，也只用一个引物，但所用的引物是在Alu序列［反向重复序列］的基础上设计的，扩增的是copia序列之间的DNA序列［16］。

2.2.2.8　ISTR(inverse sequence-tagged repeat)

　　这种技术与SPAR技术也相近，也所用的引物是在copia序列［反向重复序列］的基础上设计的，扩增的是copia序列之间的DNA序列［16］。

2.2.2.9　IFLP (intron fragment length polymorphism)

　　检测的对象是内含子的长度差异［9］。

2.2.2.10　RAMPO(random amplified microsatellite polymorphism)

　　RAMPO的英文全名与RAMP的英文全名相近，但实验方法却不同。RAMPO的基本步骤是：先用一个单一的随机引物(即RAPD引物)对基因组DNA扩增，用电泳将扩增片段分开，然后，把凝胶转移到尼龙膜上，使之与一个带有放射性标记(或其它标记)的与SSR互补的寡核苷酸探针(如［CA］8和［GA］8)杂交，放射自显影后可得到新的多态性类型［15］。

2.2.2.11　先找到RFLP标记后，对RFLP探针进行测序，再合成适当的PCR引物，这样可发现新的STS标记。这也可称为RFLP-PCR。

2.2.3　扩增片段长度多态性(Amplified Fragment Length Polymorphism,缩写AFLP)：其特点是把RFLP和PCR结合了起来。其基本步骤是：把DNA进行性内切酶酶切，然后选择特定的片段进行PCR扩增 (在所有的性片段两端加上带有特定序列的"接头"，用与接头互补的但3′端有几个随机选择的核苷酸的引物进行特异PCR扩增，只有那些与3′端严格配对的片段才能得到扩增)，再在有高分辨力的测序胶上分开这些扩增产物，用放射性法、荧光法或银染染色法均可检测之。这种技术又称为"选择性性片段扩增"［22］。Arencidia et al.(1998)［1］在AFLP的基础上发展出AFRP技术(amplified fragment random polymorphism)，加的PCR引物中一侧为AFLP引物，一侧为随机引物。

2.2.4　单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，缩写SNP)技术

　　同一位点的不同等位基因之间常常只有一个或几个核苷酸的差异，因此在分子水平上对单个核苷酸的差异进行检测是很有意义的。目前SNP作为一种新的分子标记，已有2000多个标记定位于人类染色体上，在植物上也在进行开发研究。可在胶上也可不在胶上就能检测出SNP，但检测SNP的最佳方法是新近发展起来的DNA芯片技术。

参考文献

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三, 两种重要的分子标记技术AFLP和SNP及其在植物基因组研究中的应用

(一)扩增片段长度多态性(AFLP)的原理方法

及其应用

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下面内容选自: 吴敏生　戴景瑞, 扩增片段长度多态性(AFLP)

——一种新的分子标记技术,植物学通报,1998年 第4期

在过去几十年里，遗传育种科学发生了巨大变化，对世界粮食生产产生了很大影响。在这期间，优良品种的贡献在农作物增产总额中占到30～40%。但由于应用传统的育种方法育成一个新品种往往需要许多时间(6～7代)，甚至长达10年，大大延缓育种进程，不利于粮食生产。

　　近十年来，分子遗传学对遗传育种技术产生了巨大影响，大量的分子标记技术用于遗传育种，如基因组分析、基因克隆、品种鉴定、外源基因导入(Bell和Eckey, 1994；Gebhardt和Salamini, 1992； Rafalski和Tingey, 1993； Tanksley等，19)。分子标记研究的关键是建立饱和的遗传图，饱和的遗传图对于定位克隆是极其重要的(Heum等，1991; Lander和Green, 1987)。最早用来做图的分子标记技术是RFLP(Botstein等，1980)，目前已构建了大批的RFLP图谱。做图的目的之一是染色体步行，染色体步行的2个条件：(1)是目标基因附近有紧密连锁的DNA标记；(2)是知道这些标记与目的基因的位置，一旦建立与目的基因紧密连锁的分子标记图，就可以找到染色体步行的起始点，从而进行定位克隆。但是，RFLP技术用于做图比较费时，难以分析大量的DNA，而且遗传图饱和度低，分子标记间距离比较大，不利于定位克隆(Liu等, 1994； O’Brien, 1993)。

　　1990年以来，发展了RAPD、DAF、AP-PCR技术(Caetano-Anolles, 1991； Welsh和McClelland, 1990； Williams, 1990)，这些方法主要根据PCR技术，用随机引物扩增DNA，在不需要知道DNA序列情况下，产生DNA片段的指纹模式，这些方法最大的缺点是它们对反应条件非常敏感，重复性差，因而了其应用。

　　最近，发展了一种新的DNA指纹技术，叫做AFLP技术(Amplified fragment length polymorphisms)。这种技术是由Zabeau发现，并由Vos发展起来(Vos, 1995; Zabeau和Vos, 1992)。AFLP技术是一种选择性扩增性片段的方法，这种方法由于结合了RFLP和PCR的优点，具有比RAPD更大的优越性。自从AFLP技术问世以来，已广泛用于基因鉴定、基因作图、基因表达等方面，可以预计，该方法将有着广阔的应用前景，为了推广这项技术，本文对AFLP技术的原理、方法、应用做了介绍，对AFLP技术未来应用进行了探讨。

1　原理

　　AFLP技术是一项新的分子标记技术，其原理是基于PCR技术扩增基因组DNA性片段，基因组DNA先用性内切酶切割，然后将双链接头连接到DNA片段的末端，接头序列和相邻的性位点序列，作为引物结合位点。性片段用二种酶切割产生，一种是罕见切割酶，一种是常用切割酶。这项技术包括三个步骤：1.DNA被性内切酶切割，然后与AFLP聚核苷酸接头(adapter)连接；2.利用PCR方法，通过变性、退火、延伸循环，选择性扩增成套的性片段，经过多次循环，可使目的序列扩增到0.5～1μg；3.利用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离扩增的DNA片段。利用一套特别的引物在不需要知道DNA序列的情况下，可在一次单个反应中检测到大量的片段。由于AFLP扩增可使某一品种出现特定的DNA谱带，而在另一品种中可能无此谱带产生，因此，这种通过引物诱导及DNA扩增后得到的DNA多态性可做为一种分子标记。所以说AFLP技术是一种新的而且有很大功能的DNA指纹技术。

2　实验方法

2.1　引物和接头(adapter)合成

    引物和接头合成是AFLP技术中重要的步骤，引物和接头的改进是AFLP较RAPD、PCR最主要的变革。

　　引物可通过DNA自动合成仪人工合成，AFLP引物的设计主要由接头的设计决定，AFLP引物的一个重要特征是所有引物起始于5′G残基，5′端是与接头序列相对应的。

　　引物主要由3部分组成：①核心序列(CORE)；②酶特异序列(ENZ)；③选择性延伸序列(EXT)(Zabeau和Vos，1992)。

　　如EcoRI引物和MseI引物(EXT用NNN表示，N表示任何碱基)

　　接头也可以由DNA合成仪合成，设计是严格按照PCR引物设计原则进行的，其合成直接影响到引物合成，所以很重要。

　　接头一般由二部分组成：核心序列和酶特异序列，如EcoRI接头和MseI接头：

　　EcoRI-adapter: 5-CTCGTAGACTGCGTACC

CATCTGACGCATGGTTAA-5

　　MseI-adapter:5-GACGATGAGTCCTGAG

TACTCAGGACTCAT-5

2.2　模板DNA制备

　　扩增反应中的模板DNA可以用基因组DNA也可以用cDNA。首先，双酶切目的DNA，如EcoRI/MseI两种酶。然后用T4 DNA连接酶，将EcoRI和MseI接头与酶切片段连接起来，连接后，稀释10倍，-20℃贮存。则模板DNA可用于扩增反应。

　　AFLP反应对模板DNA浓度不是很敏感，在25ng甚至25pg时，均可以观察到多态性带，但为了实验的准确性，DNA浓度不能太低，而且模板DNA最好纯一些，以防干扰实验。

2.3　DNA扩增反应

　　AFLP扩增一般使用二个引物，扩增的条件依赖于AFLP引物的选择性核苷酸的性质，扩增反应需经过几十次循环。当引物无或有一个选择性核苷酸时，AFLP只需20个循环，每一次循环分为以下几步：94℃，DNA样品变性30秒，56℃退火1分钟，72℃延伸1分钟。当引物有2或3个选择性核苷酸时，AFLP反应是36个循环。第1个循环是：94℃DNA变性30秒，65℃退火30秒，72℃延伸1分钟；第2到13个循环，DNA退火温度每次递减0.7℃，其余步骤同第一个循环；第14～36循环，退火温度是56℃，其余步骤同第一个循环(Vos, 1995)。

　　对于复杂基因组DNA，AFLP扩增不同于简单基因组，要分两步进行，即第一步是预扩增，用2个AFLP引物，AFLP引物只有一个选择性核苷酸，扩增后，反应混合物稀释10倍，DNA用作模板，进行第二次扩增，第二次扩增的引物是具有3个选择性核苷酸的引物。两步法有以下好处，一是可减少“Smear”背景污染；二是可为AFLP反应提供大量的模板DNA。

2.4　凝胶电泳

　　扩增反应结束后，每个DNA样品取2μl，在5%聚丙烯酰胺凝胶上电泳，在常压、110W下，电泳2小时，电泳后，凝胶用10%乙酸固定，凉干，银染或放射自显影，得到被扩增的DNA谱带，通过比较即可找出不同样品DNA谱带的差异。

3　AFLP技术的应用

3.1　遗传作图

　　很久以来，科学家希望利用遗传图和遗传标记来加速植物育种进程，自1980年，Botstein等(1980)，提出用RFLP构建人的遗传图谱以来，现在已构建了许多生物的RFLP图，但大多数图的密度很低(O’Brien, 1993；Tanksley和Hewitt, 1988)，因此需要构建高密度的遗传图。

　　高密度遗传图在基础研究和应用研究方面具有很多功能：①它们是染色体步行的关键工具。为了克隆一个基因(利用染色体步行)必须找到一个与目的基因紧密连锁的分子标记，这样才能提供一个步行的起始点，而高密度遗传图可以为染色体步行提供起始点；②高密度遗传图在育种上有直接的应用。它们至少可确定一个与任何目的基因紧密连锁的分子标记，利用这些连锁标记，在育种计划中就可以根据图选择目的基因(Burr等，1983； Tanksley等, 19；Wicking和Williamson, 1991)；③高密度遗传图使基因组完全被分子标记覆盖(即无很大的标记空隙)。这一点对于检测数量性状基因(QTL)尤为重要(Lander和Botstein, 19)。

　　除了利用RFLP分子标记遗传做图外，人们还利用RAPD技术做图，但RAPD技术重复性差，在一次实验中不能得到大量的多态性DNA片段，因而也了其应用。

　　1993年，Zabeau等(1992)发明了AFLP技术，由于AFLP技术重复性好，且在一次实验中可观察到大量的DNA多态性片段，比RAPD、RFLP好。AFLP不仅能缩小抗病基因与连锁标记之间的距离，而且在RFLP遗传图上，可增加染色体末端标记和填充RFLP空隙，不干扰RFLP标记簇(Becker等，1995)。因而AFLP可以构建高密度的遗传图。

　　近几年来，植物遗传学家和育种家已着手构建重要作物的AFLP图，或在RFLP图上补充AFLP标记以构建饱和的遗传图。Colwyn等(1995)，在构建番茄AFLP图时，利用分离群体和728个引物，从42000AFLP片段筛选了3个AFLP标记，并将其定位在番茄第1条染色体短臂上。在这次实验中，每个引物组合产生58个AFLP片段，33.3%有多态性。Ballvora等(1995)利用马铃薯的分离群体和144个引物组合，进行AFLP分析，每个引物组合平均产生100个AFLP片段，38%有多态性，从5500个多态性位点，发现2个AFLP标记，并将其定位在马铃薯第7条染色体上。Meksem等(1995)，在马铃薯RFLP图谱上添加AFLP标记，利用分离群体和108个引物组合，从3200AFLP片段中发现有29个与马铃薯第5染色体R1基因(R1基因是抗Phytophthora infestans特异小种的基因)连锁的AFLP标记，并将其定位在第5染色体上。在大麦上，Becker等(1995)利用双单体，将118个AFLP标记定位在大麦RFLP图上，这118个AFLP标记分布在大麦所有染色体上，有趣的是，AFLP标记很少干扰RFLP标记簇，而是成群地分布在RFLP标记附近，大大增加了遗传图的饱和度。在水稻上，Cho等(1996)利用一套近等基因系，只用2个引物组合，就找到2个AFLP标记，并分别将它们定位到第1、第9染色体上。

　　随着AFLP技术的进一步完善，许多植物将有AFLP图。

3.2　利用AFLP快速鉴别与目的基因紧密连锁的分子标记

　　定位克隆技术是分离未知产物基因的重要技术，基本前提是基因定位，然后以紧密连锁的分子标记为起点，通过染色体步行，最终克隆基因。所以要克隆基因，必须鉴别与目的基因相连锁的分子标记。

　　近年来，一种新的称为分群分析法(Bulk segregate analysis, BSA)的方法已发展起来，用于鉴定与目的基因连锁的分子标记。Arnheim等(1985)开始提出这种方法，但它是用RFLP来做，用RFLP的缺点是找出多态性的效率比较低。Michelmore等(1991)用这种方法找到三个与莴苣霜霉抗性基因相连锁的RAPD标记，但RAPD方法的效率也不是很高。

　　Colwyn等(1995)提出用AFLP技术来筛选某一性状的连锁标记。利用BSA方法，即利用两个的分离群体的各个个体的DNA的混合样品，这两个分离群体只有一个性状有差别或是同一性状的两个极端类型，这样就等于人为地产生了一个近等基因系。Colwyn等(1995)很快找到三个与番茄抗性基因Cf-9紧密连锁的AFLP标记。Ballvora等(1995)也利用BSA法，进行AFLP分析，找到了与抗线虫基因紧密连锁的AFLP标记。

3.3　AFLP辅助的轮回选择育种

　　今天的作物品种是多年直接选择和间接选择的结果，随着有关的品种或种中理想性状的转移，品种逐步得到改良，这一过程需要用带理想性状的材料与需改良的品种相杂交，再经过选择获得(Tanksley, 1982)。而在植物轮回选择育种过程中，亲本基因组对于子代的品种种质贡献是不同的，这对于选择是一个很重要的问题，利用AFLP技术有助于克服早期选择的盲目性。

　　Vantoai等(1996)研究了大豆轮回选择过程中，亲本基因组DNA对于子代的贡献。他们选择了30个材料，其中6个亲本材料(2个亲本是本地适应性品种，4个是外地品种)，14个第一次轮回选择的材料，10个第二次轮回选择的材料。利用一对引物，进行AFLP分析，研究结果发现，经过2次轮回选择，2个适应性亲本在后代的基因组中占75%，而4个外地品种只占后代基因组成分的25%。这个试验表明，根据AFLP标记，可以进行轮回选择，可以跟踪基因的转移情况，如果AFLP标记与要选择的基因紧密连锁，这样就可以在早期筛选植物分离群体中含目的基因的植株。

3.4　利用AFLP技术研究基因表达与

　　基因的表达，首先要转录出mRNA，再翻译成蛋白质，而后控制生物代谢过程。研究基因表达的传统方法是利用cDNA文库筛选和Northern杂交，但这种方法不能同时比较植物发育的不同时期(McClelland等, 1995)。最近利用AFLP衍生的cDNA-AFLP技术，来研究基因表达。

　　在过去，人们研究了编码主要贮藏蛋白的基因，并分离了与淀粉合成有关的基因，但是，人们不知道块茎器官发生的基因表达及过程(Koda等，1991)。Christian等(1996)采用cDNA-AFLP技术研究了马铃薯块茎发育过程基因表达。利用3个引物组合，进行块茎发育不同时期(1～10天)的cDNA-AFLP分析，得到了2个块茎特异转录的片段TDFs(TDF531和TDF536)，2个TDFs片段是与决定块茎形成的关键基因lox(脂肪氧合酶)高度同源的，这一点已由序列分析证实。经Northern杂交，发现这两个TDFs具有差异表达模式，TDF531在0～2天低水平表达，然后稳定增加，到第10天达到高峰，TDF536在第6天表达，而后增加，到第10天达到高峰。而且TDF531和TDF536在块茎中表达最高，但在根、茎、叶中没有表达。这表明AFLP研究基因表达是非常有效的方法，可同时比较植物发育的不同时期以及分离某些重要基因。

3.5　分类和进化研究

　　品种间存在较多的形态差异，这些差异在农业上很重要，也是致力于系统发育关系研究的分类学家所关注的。过去，人们利用RFLP技术进行分类及进化研究(Song等，1998；Verrier等，1990)，但RFLP技术比较费时，需大量探针。现在，由于AFLP技术可在一次实验中同时检测到更多的多态性片段，有助于遗传差异的更完全综合和在相似群进一步分类，因而用于鉴定不同品种，进行分类和研究。Smith等(1993)通过AFLP分析对44个玉米自交系进行了聚类分析，揭示了玉米自交系间的联系。Rolf(1996)利用AFLP，对24个马铃薯胞囊线虫进行了分类。这些作者认为AFLP技术与RFLP、RAPD技术产生相似的分类，但AFLP技术比RFLP、RAPD技术更容易。

4　展望

　　许多年来，人们一直希望能定向地改变生物的某些性状，定向克隆某些基因，将某些生物的优良基因定向导入另一生物中。AFLP分子标记的问世和发展为定向地对植物进行遗传操作和改良，提供了可能性，在今后的几年中，AFLP技术将日益成为植物遗传学家和分子生物学家手中的有效工具。

　　AFLP是基于PCR的方法，易于实现自动化，可在一次实验中产生大量的多态性片段，随着AFLP发展和自动化，以AFLP为基础做图，一定可以构建饱和的遗传图，而且AFLP还可以与RFLP、RAPD相结合，由于AFLP标记不干扰RFLP、RAPD标记，因而可以加速图谱制作。

　　AFLP可以加速获取重要基因的进程，AFLP与BSA(分群分析法)结合，可以找到与目的基因紧密连锁的分子标记，以AFLP标记为起点，通过染色体步行或更新的技术，定位克隆某些重要基因。在过去几年里，利用定位克隆方法已克隆了许多基因(Barbara和Scott, 1995; Churchill等，1993； Kunkel等，1993)。AFLP的进一步发展，必将克隆更多的基因，包括许多功能未知的基因。

　　AFLP也将是数量性状基因(QTL)研究的有效工具，当已知的显著表型突变型的简单等位基因已在图上定位时，这种分析就可简化QTL的鉴定，并可对QTL实施操纵。

　　许多育种目的是将基因从一个亲本转移到另一个亲本，传统方法是采用回交，有很大局限性，而用AFLP方法，可以跟踪外源基因，克服回交的缺点。一旦AFLP技术与现有的育种程序结合起来，育种进程必将大大加快，AFLP技术很可能成为商业育种中尽快取得经济效益的一种技术。

　　另外，AFLP技术还将在生物多样性、系统发育、基因表达、微生物鉴定、杂种优势预测等与遗传和育种有关的领域作出贡献。 

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(二)SNP原理方法及其应用

继基因组测序之后,单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphisms，SNP）在人类基因组研究和动物基因组研究中已经成为功能基因组研究的一个很重要的方面。随着植物基因组研究的深入，SNP也必将在植物基因组研究中上演很重要的角色。以下几篇文献可以窥见SNP对于植物遗传学研究的重大意义。

Larkin PD, Park WD, Transcript accumulation and utilization of alternate and non-consensus splice sites in rice granule-bound starch synthase are temperature-sensitive and controlled by a single-nucleotide polymorphism, Plant Molecular Biology, 1999, 40: 719-727

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下面站点对了解SNP有所帮助,尽管内容基本是关于人类和动物SNP: http://cmbi.bjmu.edu.cn/cmbidata/snp/index.htm

此站点并且和国内外很多相关站点链接.

进行SNP研究的方法很多,下表总结了一些(Ulf Landegren, Mats Nilsson, and Pui-Yan Kwok, Reading Bits of Genetic Information: Methods for Single-Nucleotide Polymorphism Analysis, Genome Research, Vol. 8, Issue 8, 769-776, August 1998):

(一) GLOBAL IR2系统

LI-COR公司的Global IR2 系统及与其配套的IRDye™ AFLP® 试剂盒和分析软件为植物AFLP的研究提供了一种完整解决方案和平台.其特点如下:

A. 极好的通量: 96个泳道,一块胶可以上样一次以上.

B. 真实胶图像以便分析

C. 低的运行费用

D. IRD700和IRD800两种红外荧光染料没有光谱重叠,有利于更好的精确的打分(scoring)

E. 最有效的分析软件

1]AFLP®过程:

1.基因组DNA的消化

2.寡核苷酸接头的连接

3.选择性预扩增以减少选择性扩增产物的数量

4.Selective amplification to reduce and fluorescently label a portion of the total digest.  

5.片段在LI-COR Global IR2 系统上的电泳 

2]IRDye™ AFLP® 试剂盒:

∙Template Preparation Kit:可以制备100个样品 

∙Selective Amplification Kits:可以选择性扩增25个模板的对不同引物组合共计1600个反应.IRD700和IRD800两种红外荧光染料已经被标记在引物上.

∙Startup Kits包括了一个template preparation kit 和一个selective amplification kit 

3]IRDye™ AFLP® 试剂盒的特征和优点:

增加了精确度 

∙Quality controlled against control band patterns. 

∙Highly reproducible results. 

节省时间 

∙Optimized for LI-COR infrared fluorescence-based instrumentation. 

∙Reliable and requires fewer protocol adjustments. 

∙Can be used on uncharacterized genomes. 

∙Kits are ready for use. 

节省经费

∙Eliminates costs associated with radioactivity. 

4]高通量:

有效抽提:使用标准DNA抽提试剂盒可以在小于8小时内抽提192个样品

KBPlus 96孔纸梳子:无泄露,保证胶的最小扭曲, reloadable (2x).

KBPlus 胶试剂:预混合,用前只需加TEMED,APS

ClickIR 8通道注射器:三分钟内由96孔板取样并加样于96个泳道

每天384个AFLP泳道:每次电泳的一块胶,上两次样,产生192个AFLP泳道(IRD700和IRD800两种红外荧光染料各96个泳道).每天两次电泳.

5]操作费用低:

利用高灵敏度红外检测使每个试剂盒可以进行更多次反应

激光器/检测器的保修期为五年

6]提供标准AFLP胶图像以便精确分析:

图像格式快速转换

多态性带易于鉴定

强弱带都可以精确检测

红外染料没有光谱重叠,因此不会妨碍分析

7]分析软件:

(1)AFLP-Quantar™:详情请登录http://www.keygene-products.com/default.htm

特点:

∙Dominant or Co-Dominant Scoring 

∙Fast: Scores gels in approximately 30 minutes 

∙Scores bands across the gel by clicking a single polymorphic band. 

∙Cross Gel Scoring: Alignment bands and markers are applied to all image with the same primer combination 

∙Question marks identify missing data. 

∙Desmiling: One click on a monomorphic band adds a desmile line. 

 (2)Gene ImagIR™

特点:

∙Imports gel images, finds lanes, calculates sizes, generates PAUP reports, and draws phylogenetic trees. 

∙Integrated database management. 

∙Designed for smaller projects 

∙Ideal for most sizing and quantification studies. 

∙Dominant scoring or phylogenetic analysis. 

Automatic band sizing and quantitation.

Relational database for sample management.

High data compatibility with a wide range of analysis programs.

Used for AFLP®, STRs, RAPDs, QPCR, expression studies, and more.

Sizing and Quantitation

Flexible analysis tools enable Gene ImagIR to analyze gel images for genetic linkage analysis, AFLP®, gene expression studies, quantitative PCR assays, and other research requiring band analysis.

Quantitative Peak Profiles

Double-clicking any band position on the gel image displays quantitative peak profiles and the gel image for verification or editing.

Automatic Database Entry and Analysis

Sized and quantitated gel data are automatically imported into Gene ImagIR's relational database, eliminating data entry errors. Genotypes and allele frequencies are automatically calculated for newly imported data, and any Mendelian errors are automatically detected. Image data are also stored in the data base for fast recall during analysis.

Phylogenetic Analysis

Data are easily exported in file formats used by popular phylogenetic and linkage analysis software.

Composite Gels

Composite gels simplify allele review. Alleles loaded on different gels can be plotted on a composite gel for more accurate comparisons.

Simple, Powerful Queries

Gene ImagIR's relational database can be searched with a simple query to identify all individuals with a certain allele, all markers that have been run on a given chromosome, or any other condition. Custom, user-designed queries are also easily constructed. When you need to verify an allele, gel images can be recalled by simply entering the locus name and sample ID numbers.

选读材料:下面文献为使用GLOBAL IR2 系统进行AFLP的极好文献,不可不读.

Myburg AA, Remington DL, O'Malley DM, Sederoff RR, Whetten RW. High-throughput AFLP analysis using infrared dye-labeled primers and an automated DNA sequencer.Biotechniques. 2001 Feb;30(2):348-52, 354, 356-7.

Klein PE, Klein RR, Cartinhour SW, Ulanch PE, Dong J, Obert JA, Morishige DT, Schlueter SD, Childs KL, Ale M, Mullet JE. A high-throughput AFLP-based method for constructing integrated genetic and physical maps: progress toward a sorghum genome map. Genome Res. 2000 Jun;10(6):7-807.

(二) PSQ 96 DNA系统

DNA序列变异的鉴定的黄金标准是DNA序列测定,而PYROSEQUENCING公司研究与开发的PSQ 96 DNA系统正迎合SNP分析的需要.此系统不需要制备胶、不需要毛细管和染料或特异标记，测序事件可以实时检测;快速、高通量、重复性好,每六秒处理一个SNP或10分钟内分析96 个SNP或每小时处理500个样品.系统及与系统配套的软件和试剂使该系统可以进行以下工作: SNP analysis, allele frequency determination和sequence analysis 

Pyrosequencing的原理

Pyrosequencing是精确和稳定地对大量的短到中等长度的DNA序列样品进行分析的技术。

第一步，测序引物和PCR扩增的、单链的DNA模板杂交，与酶—DNA聚合酶（DNA polymerase）、ATP sulfurylase、luciferase、apyrase—和底物—adenosine 5´ phosphosulfate (APS) 、luciferin孵育。

第二步，四种dNTP（dATP，dTTP，dCTP，dGTP）之一被加入反应体系，如与模扳配对（A—T，C—G），此dNTP与引物的末端形成共价键，dNTP的焦磷酸基团（PPi）释放出来。注意：反应时deoxyadenosine alfa-thio triphosphate (dATPS)是 deoxyadenosine triphosphate (dATP)的替代物，因为DNA聚合酶对dATPS的催化效率比对dATP的催化效率高，且dATPS不是luciferase的底物。

第三步，ATP sulfurylase在adenosine 5´ phosphosulfate存在的情况下催化PPi形成ATP，ATP驱动luciferase介导的Luciferin向oxyluciferin的转化，oxyluciferin发出与ATP量成正比的可见光信号。

           ATP sulfurylase

PPi+APS                      ATP

            Luciferase，ATP

Luciferin                         oxyluciferin

光信号由CCD摄像机检测并由pyrogram™反应为峰。每个光信号的峰高与反应中掺入的核苷酸数目成正比。

第四步，

ATP和未掺入的dNTP由Apyrase降解，淬灭光信号，并再生反应体系。

第五步，然后加入下一种dNTP。

在以上步骤循环进行中，互补DNA链合成，序列从pyrogram的信号峰中决定。

利用PSQ96系统进行测序分析可期望得到20-30个碱基的读序长度，但是和任何测序技术一样，最大读序长度取决于模板的二级结构、碱基组成、PCR产物质量和其他参数。

最佳化的Pyrosequencing

     Pyrosequencing反应利用的是酶级连系统，简单且强有力，给出阳性或阴性结果，每种成份和参数已最佳化，以得到高度一致的结果，精确度为99%（Pyrosequencing PSQ 96 System）。

底物浓度已最佳化

选择了Apyrase的特异浓度，保证了所有的dNTP被降解，包括ATP和dATPS

dNTP降解速率慢于掺入速率，有利于dNTP充分掺入

ATP合成速率快于ATP水解速率，使的ATP浓度和光产生正比于掺入的dNTP数目

仔细控制的试剂，保证了足够的活性和质量

待测模扳制备

  通过PCR技术将待测序列扩增，其中引物之一用生物素标记。加入STREPTAVIDIN包被的磁珠于扩增的DNA中，DNA分子通过引物的生物素和STREPTAVIDIN包被的磁珠形成复合体。DNA变性后，带生物素标记引物的单链在磁场中得到纯化，然后就可用于与测序引物退火，以便进行测序反应。

系统的优点

     可靠的化学原理和强有力的检测机理使的该系统不需要胶、毛细管\染料或特异标记，测序事件可以实时检测。

快速、高通量、重复性好—10分钟内分析96 个SNP或每小时处理500个样品或每六秒  

  处理一个SNP

简单—带有软件和为SNP分析特异设计的SNP试剂KIT的台式仪器

强有力—标准格式，标准操作程序，勿需胶或tags

灵活性—每个实验孔（test well）可以进行一个SNP或一个样品的分析

序列信息—PSQ 96 系统也能提供序列信息，确保所产生资料的高精确度和可靠性

PSQ 96系统如何工作

     PSQ 96系统利用Pyrosequencing技术为每个SNP测定10个以上碱基

带有退火引物的单链DNA模扳放入PSQ 96孔板 

酶混合物, 底物和核苷酸（ PSQ 96 SNP Reagent Kit）放在PSQ 96 试剂舱（Reagent 

  Cartridge） 

PSQ 96孔板和试剂舱放在仪器中

含SNP位点的序列输入SNP Entry软件包. 

SNP Entry软件包自动建议核苷酸的分配顺序，以条形图（bar graphs）形式展示三个可

  能的理论结果

运行中每个孔的测序过程实时展示，可以用所有的孔或选定的孔。通过从已经输入SNP 

  Entry软件包的SNP列表中选择，每个孔能安排分析一个独特的序列  

运行结束后，用SNP软件评估资料，通过比较原始资料和理论数据，确定每个样品的基

  因型

SNP软件AQ产品信息

●在大量DNA样品中定量化等位基因频率

1.自动计算等位基因频率

2.统计计算

●产生SNP序列数据库

●预测SNP分析的理论结果

●进行基因型分析

●进行原始资料的质量评估

●控制仪器

PSQ96系统产品信息

专用的96孔样品板

整合的试剂分配系统

整合的混合器桌

温度控制的反应舱

冷CCD摄像机

基于WINDOWS 2000的易学好用的软件

  系统的不同用途配置相应的软件和试剂