文章编号:1007-8738(2009)09-0816-03

急性脑梗死患者外周血单个核细胞Toll 样受体4的表达与临床的相关性

刘 舟,李敬诚,石永中(第三军医大学大坪医院神经内科,重庆400042)

收稿日期:2009-07-01; 接受日期:2009-07-15基金项目:湖南省卫生厅科研基金项目(b2007135)

作者简介:刘 舟(1975-),男,湖南长沙人,主治医师,本科

Te:l 0731-********;E -m ai :l li uyangzhou@si na .co m

Expression of Toll li ke receptor 4i n pe -ri phera-l blood mononuclear cells of pa -ti ents w ith acute cerebral infarcti on

and its correlation w ith cli nical sub -types and the severity of the disease

LI U Zhou,LI J ing-cheng,SH I Yong-zhong

D epart m ent o f N euro logy ,Dap i ng H osp ita,l T hird M ilita ry M ed-i ca lU n i versity ,Chongqi ng 400042,Chi na

[Abstract] AI M:To inves tigate t he exp ress i o n o f To ll

like recep t o r 4(TLR 4)in pe riphe ra-l b lood mononuclear ce lls (PBMC )o f pa tien t s w ith acu t e ce rebra l in f a rcti o n and it s corre la tion w ith clin ica l sub t ype s and t he sever ity o f the d is -ease .M ETHODS :The l e ve ls ofmRNA and p ro t e in of TLR 4in PBMC of 66patients w ith acu t e cereb ra l in fraction were exa m ined by rea-l tm i e q uan titative reve rse transcr i p tion po-l ymerase cha i n reaction (RT -PCR )and flow cyto m e try (FCM ),re spe ctive ly .C lin ica l neuro l o g ica l de ficit score and O CSP (O xford Comm un ity S troke P ro ject)c li n ica l sub t ype w ere per f o r med in t he pa tien ts w ith in 3days a ft e r adm is -si o n .RESULT S :The exp ress i o n o f TLR 4in PBMC o f pa -ti e n ts w ith acu t e ce rebra l in frac tion (positive rate :66.87?16.27%,fluorescence in t ens ity :11.62?4.39)was s i g n if -i cantly h igher than no r ma l con tro ls (P <0.01,respective l y ).66pa tien t s w ere d ivided into 4groups ba s ed on OCSP .The re w ere 9pa ti e nts w ith TAC,I 39pa tients w ith PAC ,I 7pa ti e n ts w ith POC ,I and 11pa tien ts w it h LAC.I The d iff e r -ences i n the exp ressi o n leve ls o f TLR 4p ro t e in and mRNA in these g roup s have no st a tistic significance .M eanw hile ,there w ere 27m ild cases ,30med ian cases ,and 9se vere cases acco rd ing to the ne uro log i c a l de fi c it score.The d iff e r -ences i n the exp ressi o n leve ls o f TLR 4p ro t e in and mRNA in these g roup s have st a tistic sign ifi c ance (P <0.05).The ex -p ressi o n o f TLR 4pro t e in and mRNA w ere corre la t ed pos-i tive ly w it h the seve rit y o f the d isease (r =0.85,

0.87;

P =0.01,0.01).CONCLUSION:The increased exp ression o f TLR 4m ay be assoc i a t ed w it h t he p rogression o f acu t e

ce rebra l in f a rction .It may be a risk f ac t o r o f acute cereb ra l infarction .

[K ey w ords]To ll like recep t o r 4;acu t e ce rebra l in f a rction ;

ce rebra l infarction clin ica l sub t ype ;neuro log-i ca l de ficit sco re

[摘要] 目的:探讨急性脑梗死患者外周血单核细胞T o ll 样受体4(TLR 4)的表达及其与患者的临床亚型及病情严重程度的相关性。方法:采用流式细胞仪分析技术和实时定量RT-PCR 技术分别测定66例急性脑梗死患者外周血单核细胞T o ll 样受体4的表达水平,于入院3d 内病情稳定后对患者进行临床神经功能缺损程度评分,并按照O x ford C o mm un ity Stroke P ro ject 完成脑梗死患者的临床分型。结果:与健康对照组相比,急性脑梗死患者外周血单个核细胞(PB M C)中TLR4蛋白表达的阳性率(66.87?16.27)%及表达量(即荧光强度,11.62?4.39)均显著升高,差异有统计学意义(P <0.01)。66例脑梗死按照O x f o rd Co mmunity Stroke P ro ject 临床分型,分为TAC I 9例、PAC I 39例、POCI 7例和LA CI 11例,PB M C 中TLR4蛋白和mRNA 的表达量在各组间的差异均无统计学意义;按神经功能缺损程度评分标准将66例患者分为轻型27例、中型30例和重型9例,各组PB M C 中T LR 4蛋白和mRNA 的表达量差异有统计学意义(P <0.05)。PB M C 中TLR 4蛋白和mRNA 的表达量与病情的严重程度均呈正相关(P <0.05)。结论:外周血单核细胞To ll 样受体4的表达增高与急脑梗死的发生和严重程度有密切关系,是脑梗死发病的一个危险因素。

[关键词]T o ll 样受体4;急性脑梗死;脑梗死临床分型;神

经功能缺损程度

[中图分类号]R 392.12

[文献标识码]A

急性脑梗死(acute cerebral infarction,AC I)是神

经系统的常见病和多发病,其病理生理改变主要有细胞能量代谢障碍、细胞内钙超载、自由基、兴奋性氨基酸毒性作用、炎症反应和部分细胞凋亡等[1,2]

。Toll 样受体(To ll like receptor ,TLR )分布广泛,主要表达于单核细胞、巨噬细胞、树突细胞等细胞膜上,是与微生物识别有关的天然免疫受体家族,属模式

识别受体[3]

。TLRs 最突出的生物学功能是促进细胞因子的合成与释放,引发炎症反应;另一项功能是促进抗原提呈细胞的成熟,从而诱导机体的获得性免

疫反应[4]

。因此,TLRs 是机体介导天然免疫转向获得性免疫的桥梁。1997年,TLR4首次被发现,随后经研究证实,TLR4在抗细菌、抗病毒的炎症反应中,

1对象和方法

1.1对象2006-10/2009-02收集我院神经内科的急性脑梗死患者66例,其中男38例,女28例,年龄63.16?9.45岁。临床诊断标准参见1995年全国第4届脑血管病学术会议制定的标准。排除既往有脑卒中、短暂性脑缺血发作、心肌梗死、糖尿病、甲状腺疾病、肝肾功能不全、自身免疫性疾病、使用激素或免疫抑制剂者、胃部疾病及巨幼细胞贫血病史者。入院3d内病情稳定后完成脑血栓形成患者临床神经功能缺损程度评分[6]和按OCSP(O xford Community S troke P ro ject)[7]完成脑梗死临床分型。对照组为同期体检证实的健康者,共60例,其中男36例,女24例,年龄(61.08?

11.26)岁。

1.2方法

1.2.1标本采集及处理取禁食12h以上、清晨空腹肘静脉血5mL,以EDTA二钾盐抗凝。0.4mL用于流式细胞仪检测,其余样品250g/m i n离心5m i n,吸出血浆,加入与血浆等体积的生理盐水,旋涡器上混匀,以F i co ll分层液(为中国医学科学研究院血液学研究所产品)分离收获单个核细胞,加入RNA later200L L,打散细胞沉淀,4e保存2~3h,转-20e下冷冻保存备用。

1.22流式细胞仪检测PB M C中T LR4蛋白的表达量标本收集完毕后,复苏PB M C,以PBS液调整细胞密度为2@109/L,取细胞悬液100L L,加入5L L藻红蛋白(phycoery t h ri n,PE)交联的小鼠抗人TLR4单克隆抗体(mA b)(eB iosc ience,San D iego,CA,U SA),以PE交联小鼠Ig G2a抗体(eB i o sc i ence, San D iego,CA,U SA)作为阴性对照。室温避光孵育30m i n 后,与适量的红细胞裂解液混合,然后用含有牛血清白蛋白和叠氮化钠的去污液洗涤2次,用500L L去污液重悬细胞后上流式细胞仪(Becton D ick i nson FA CS Cali bur)检测,测定PB M C的T LR4蛋白的表达量。

1.2.3实时定量RT-PCR检测PB M C中TLR4mRNA的表达量(1)总RNA提取:采用TR Izo l一步法快速提取细胞总

RNA并测定A

260和A

280

值,计算总RNA浓度。(2)c DNA合

成:采用AMV逆转录酶法。反应总体积10L L,总RNA模板250ng,25mmo l/L M gC l

2

2L L,10@逆转录反应缓冲液1L L,各10mmo l/L的d NT Ps混合物1L L,RNA酶抑制剂0.25L L,5U/L L AMV逆转录酶0.5L L,O ligo dT2Adaptor 0.5L L,以无RNA酶的灭菌水补充体积到10L L,混均后离心。PCR仪上42e反应30m i n,然后99e加热5m i n,冰浴保存备用。(3)实时定量RT-PCR:B io-R ad i Cyc l e r实时定量PCR仪检测PB M C中TLR4mRNA的表达量,以B-ac i n作内参。引物、FAM标记的探针由上海生工公司合成。引物序列如下:TLR4,上游引物5c-AGA GCT GAA ATG GAG GCA CC-3c,下游引物5c-AGG ACC GAG GCA GCT CTT G-3c,扩增产物长325bp;B-aci n,上游引物5c-CAC CCA CAC TGT GCC CAT CTA CGA-3c,下游引物5c-CAG CGG AAC CGC TCA TTG CCA ATG-3c,扩增产物长300bp。反应总体积25L L:10 L m o l/L上下游引物各0.5L L,5L mo l/L探针0.6L L,逆转录物1L L,5@R ea-l ti m e PCR Buffer5L L,各10mm o l/L d NTP sM i x true0.75L L,250mm ol/L M g2+So l u ti on0.5L L,以无RNA酶的灭菌水补充体积到25L L。PCR反应条件: 94e1m i n,然后95e15s,65e25s,共循环45次。计算方法:以同一份标本的TLR4拷贝数/B-acin拷贝数表示TLR4基因表达量。

1.2.4统计学分析所有数据用SP SS13.0处理,计量资料均用x?s形式表示;采用V2检验、t检验、方差分析。P< 0.05为差异具有统计学意义。

2结果

2.1急性脑梗死患者PB M C中TLR4蛋白的表达水平与健康对照组相比,急性脑梗死患者PB M C中TLR4蛋白表达的阳性率及表达量(即荧光强度)均显著升高,差异有统计学意义(P<0.01,表1)。

表1急性脑梗死患者PB M C中T LR4蛋白表达流式细胞仪检测结果

T ab1Express i on level o f TLR4i n PB M C o f pa ti ents w it h AC I

(x?s) Group n

Positive

rate(%)

Fl u orescen ce

i n tensity

Contro l609.86? 5.73 2.31?1.98

AC I6666.87?16.27b11.62?4.39b

b P<0.01vs con trol group.

2.2急性脑梗死患者PBM C中TLR4mRNA的表达水平

实时定量RT-PCR法检测急性脑梗死患者PB M C中TLR4mR-NA的表达。标准曲线的相关系数为0.998,表明标准曲线可靠。结果显示:在A CI组TLR4mRNA的相对表达量为2.06?

0.28,明显高于健康对照组(0.27?0.06),差异有统计学意义(P<0.05),与TLR4蛋白表达的检测结果一致。

2.3急性脑梗死患者PB M C中TLR4的表达量与脑梗死临床亚型的相关性66例脑梗死患者按照Ox ford Co mmun ity S troke P ro ject完成脑梗死患者的临床分型,分为TA CI9例、PA CI39例、PO CI7例和LA CI11例,各组PB MC中TLR4蛋白和mRNA的表达量见表2,组间差异无统计学意义(P>0.05)。可见,PB M C中TLR4的表达水平与脑梗死临床分型无关。2.4急性脑梗死患者PB M C中TLR4的表达量与脑梗死病情严重程度的相关性66例脑梗死患者按神经功能缺损程度评分标准将病例组患者分为轻型27例、中型30例和重型9例,各组PB M C中T LR4蛋白和mRNA的表达量见表3,组间差异有统计学意义(P<0.05)。PB M C中T LR4蛋白和mR-NA的表达量与病情的严重程度均呈正相关(r=0.85,0.87; P<0.05)。

表2急性脑梗死患者PB M C中TLR4的表达量与脑梗死临床亚型的相关性

T ab2Co rre lati on of TLR4pro te i n and mRNA expression i n PB-M C w ith cli n i ca l subtypes of AC I

C li n ical s ub t yp es n

TLR4

protei n(%)

TLR4

mRNA

TAC I965.32?14.081.98?0.23

PAC I3966.91?16.122.08?0.31

POC I767.19?13.252.01?0.22

LAC I1165.82?11.092.05?0.24

表3急性脑梗死患者PB M C中TLR4的表达量与脑梗死病情严重程度的相关性

T ab3Co rre lati on of TLR4pro te i n and mRNA expression i n PB-M C w ith the severity o f ACI

Severit y n TLR4protei n(%)TLR4mRNA

L i gh t2753.81?10.021.07?0.17

M oderate3060.12?12.331.88?0.29 Severe968.92?15.62a2.63?0.38a

a P<0.05vs li gh t and m oderate groups.

3讨论

有研究发现[8],小鼠缺血再灌注后,TLR4缺陷小鼠的脑含水量、脑梗死面积及神经功能缺损评分均明显低于TLR4功能正常的小鼠,说明TLR4在脑缺血再灌注损伤中发挥着重要作用,同时发现TLR4缺陷降低了脑缺血再灌注的损伤可能是通过降低炎性细胞因子的产生而降低再灌注后脑组织的炎性损害。另有研究显示[9],中枢神经系统表达TLR4的主要细胞是小胶质细胞。脑梗死时缺血缺氧所促发的血管内皮通透性改变,脑组织坏死物质释放,吸引外源性的单核/巨噬细胞、淋巴细胞趋化聚集,成为加剧炎性损伤的效应细胞,这些细胞均有丰富的TLR4表达。前期的研究发现脑梗死患者急性期外周血单核细胞TLR4mRNA表达上调,由此通过促使炎性因子产生分泌增多来介导脑缺血炎性损伤[10]。

本研究我们分析了急性脑梗死患者外周血单核细胞中TLR4的表达情况,及其与疾病临床亚型和病情严重程度的相关性。与健康对照组相比,急性脑梗死患者PB MC细胞TLR4蛋白及mRNA明显增高,并与病情的严重程度呈正相关。此结果与目前TLR4在动脉阻塞疾病、心肌缺血再灌注损伤、肝脏缺血再灌注损伤的结果基本一致,即TLR4参与了急性脑梗死后的缺血性炎症损伤。综上所述,外周血单核细胞TLR4的表达增高与急性脑梗死的发生和严重程度有密切关系,是脑梗死发病的一个危险因素,通过检测外周血单核细胞TLR4的表达水平可以识别脑梗死的高危患者,有利于采取积极措施对疾病进行合理的控制和监测。

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