质谱及色谱 质谱联用技术在多糖结构

分析中的应用

叶 林,张 虹*

(浙江工商大学食品与生物工程学院,杭州310035)

摘 要:综述了从1968-2010年间质谱及色谱 质谱联用分析法在多糖结构分析中的应用,包括电子轰击质谱、化学电离质谱、快原子轰击质谱、电喷雾质谱、基质辅助激光解吸离子化质谱、气相色谱 质谱、液相色谱 质谱和毛细管电泳 质谱法(引用文献42篇)。

关键词:质谱;色谱 质谱联用;多糖;结构分析;综述

中图分类号:O657.63 文献标志码:A 文章编号:1001 4020(2010)11 1355 05

Application of Mass Spectrometry and Chromatography and Mass Spectrometry in Hyphenation to Structural Analysis of Polysaccharides

YE Lin,ZHANG Hong*

(College of Food S cience and Bio Engineer ing,Zhej iang I ndustr ial and Commer cial Univer sity,H angz hou310035,China)

Abstract:A r ev iew was g iven on the prog ress of application of mass spect rometr y(M S)as well as chromat og raphy and M S in hyphenation to the structural ana lysis of polysacchar ides dur ing the y ears fr om1968to 2010.T he methods o f EI M S,CI M S,F AB M S,ESI M S,M A LD I M S,G C M S,L C M S and CE M S w ere presented(42r ef.cited).

Keywords:M ass spect rometr y;Chro matog raphy and mass spect rometr y in hyphenatio n;Po lysaccha rides;

Structural analysis;Review

糖类的研究已有百余年的历史,在经历了一个相对寂静时期之后,近年来又开始活跃起来。近30多年,特别是近10年的研究,彻底改变了人们对糖的原有认识。长期以来,人们一直认为糖只是一种能量物质或结构物质,近年来随着对糖类研究的不断深入,人们发现糖是除核酸和蛋白质之外另一类重要的生命物质,具有多种重要的生理活性,如抗肿瘤、抗凝血、降血糖、降血脂等免疫调节作用。由于糖类各种生理活性的发现,使得糖类成为目前研究的热点。

多糖是醛糖和(或)酮糖通过糖苷键连接在一起的天然聚合物,它可参与细胞的生命活动,具有多种

收稿日期:2009 04 19

作者简介:叶林(1985-),男,浙江衢州人,硕士研究生,研究 方向为水产品安全。

*联系人生物学功能。然而并不是所有的多糖都具有活性,多糖的活性在很大程度上是由它的结构决定的。因此对于糖结构的研究,无论是对高活性糖的寻求和开发,还是对糖生物学中构效关系的探索与研究,都具有至关重要的意义。

在糖类的分析中,传统的化学和生化方法有酸水解、甲基化、酶解、旋光度测定等。近年来,核磁共振、激光拉曼光谱、红外光谱及色谱等也用于糖类分析。但由于糖类具有结构复杂、不均一性以及没有显色基团等特点,使得糖类在光谱、色谱分析上难度较大。而质谱及其联用技术则可较为有效地克服这些困难。质谱技术于20世纪50年代末开始用于糖的分析,它可以提供相对分子质量、多糖的单糖组成、糖苷键的连接方式以及分支状况等多种信息,在糖类的分析中发挥着不可替代的作用。近年来,质谱技术更是飞速发展,各种软电离技术相继诞生,如

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快原子轰击质谱、电喷雾质谱、基质辅助激光解吸离子化飞行时间质谱等,使糖生物学的研究取得了很大的进展。本文综述了各种质谱技术在糖类分析中的应用。

1 质谱在糖类分析中的应用

质谱分析是现代物理与化学领域内使用的一种极为重要的工具,它是通过将样品转化为运动的气态离子并按质荷比大小进行分离记录的分析方法。质谱可以提供相对分子质量、结构碎片以及分子结构等信息,因而被广泛地应用于有机化合物的结构分析。由于最初不能直接测定热稳定性差、难挥发和极性强的生物大分子,所以糖化合物须首先通过甲基化或乙酰化等衍生化手段转变成可挥发性的衍生物,方可进行质谱分析。随着质谱技术的发展以及各种软电离技术的不断诞生,质谱技术已经可以分析非衍生化多糖,在糖类的结构分析中占有重要地位。

1.1 电子轰击质谱

电子轰击质谱(EI M S)是最早用于多糖分析的质谱技术,气化后的样品分子进入离子化室,受到由钨或铼灯丝发射并加速的电子流的轰击产生正离子。它可提供有机化合物最丰富的结构信息,有较好的重现性,且裂解规律的研究也最为完善,被广泛地应用于有机化合物的结构分析,然而它却不适合难挥发和热稳定差的样品。因此在应用于糖类分析时,需采用甲基化或乙酰化等方法将其转变为可挥发的衍生物,这对于聚合度较低的糖而言,不但可大大增强挥发性和热稳定性,而且可通过鉴定衍生物碎片离子来确定其中游离羟基的位置,从而确定各糖残基的连接方式。陆德培、孙思恩等研究了全乙酰化低聚木糖的质谱,分别对聚合度1到6的低聚木糖的质谱裂解规律进行了研究,获得了全乙酰化木糖的高分辨质谱数据[1]。该法适合于糖的全甲基化、全乙酰化及完全三甲基硅烷衍生物的分析,可得到典型的裂解模式,不仅可确定连接方式,而且还可以确定每个糖环的大小[2],但对于聚合度较高的寡糖和多糖,由于其衍生物挥发性和热稳定性依然很差,不适于EI M S测定。

1.2 化学电离质谱

化学电离质谱(CI M S)是引入一定压力的反应气进入离子化室,反应气在具有一定能量的电子流的作用下电离或者裂解。生成的离子与反应气进一步发生反应或与样品分子发生离子分子反应,通过质子交换使样品分子电离。与EI M S相比,CI MS 由于所传递的能量较少而更容易得到较强的准分子离子峰。常用的反应气有甲烷、异丁烷和氨气。如以NH3为反应气体就能给出[M+NH4]+作为基峰,从而很容易推导出相对分子质量。BOON等[3]以NH3为反应气体,对海洋胶体有机物进行分析,确定了水溶性有机物的组成。以NH3作为反应气,可以提供更专一性的软电离条件,对于糖类可以更有效地电离。Lom ax等[4]以NH3为反应气,观察到聚合度为15的同多糖。此外BOON等还以NH3和ND3为反应气体与EI M S进行对比,通过对比CI MS可以得到更为丰富的质谱信息。一般在糖的研究中,以甲烷或异丁烷为反应气体时,仍很难得到准分子离子峰,而往往得到失去一分子水的离子峰[1]。

CI MS除可测定某些糖的相对分子质量外,还可提供聚合度较低的糖的结构信息,如Reznicek 等[5]以氨气为反应气,确定了hetero pappussaponin 2中糖部分(四糖)的连接方式和连接位置,但不适于聚合度高的多糖的结构分析。与其他软电离技术相比,CI MS灵敏度高(相当于EI M S的10倍),操作简便,对EI M S是重要的补充[1]。

1.3 快原子轰击质谱

快原子轰击质谱(FAB MS)是20世纪80年代初期发展起来的一种新的软电离技术,它与传统质谱技术的显著区别在于样品受加速原子或离子的轰击可直接在基质溶液中电离。由于该法被分析样品不须经过气化而直接电离且离子化能力强,所以可用于强极性、挥发性低、热稳定性差及相对相对分子质量大的样品,且可以不需衍生化直接进行质谱分析[6 7]。在快原子轰击过程中,样品通过正离子方式增加一个质子或阳离子,或通过负离子方式失去一个质子产生准分子离子作为谱图的主要信号,并给出反映连接顺序等信息的碎片。因此,FAB M S可用来测定寡糖链的相对分子质量,同时还可以根据相对分子质量计算出寡糖的聚合度。

尽管衍生化对FA B M S并非必不可少,但与未经衍生化的糖相比,全甲基化或全乙酰化均可显著提高FAB MS测定的灵敏度,从而能简化图谱中碎片峰的解析。Suzuki等[8]分析了全甲基化和全乙酰化的寡糖和糖肽,这些化合物的相对分子质量为5000~15000u。全甲基化衍生物由于甲基的引入

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而使底物相对较小的质量数得到增加,同时大大提高了热稳定性和挥发性,故已广泛用于糖复合物的质谱分析[9]。

FAB MS已被证明是分析糖类结构最为有力的方法之一,它不仅可以测定寡糖及其衍生物的相对分子质量,而且可测定聚合度高于30的糖的相对分子质量,并可确定糖链中糖残基的连接位点、序列以及新组分的鉴定。Chizhov a等[10]以硫代甘油作基质,采用FAB M S分析了8种不同来源的海带多糖,结果表明在8种样品中有6种样品含有M 链和G 链,另两种样品含有M 链,并以N 乙酰己糖胺为末断,这是首次在褐藻多糖中发现N的存在。Lac ko等[11]用FAB MS测定了重组人体血浆中LCAT 的N 连接糖结构。

1.4 电喷雾质谱

电喷雾质谱(ESI MS)是从去溶剂后的带电液滴形成气相离子的过程,通过这种软电离方式得到的分子离子往往带有多个电荷,因此它分析的相对分子质量范围很大,既可适用于小分子分析,又可用于多肽、蛋白和糖类的分析。LIU Yan等[12]认为ESI M S是一种有效的测定多糖相对分子质量的方法,对低聚甘露糖醛酸和低聚古露糖醛酸的相对分子质量进行了测定。Read等[13]采用ESI M S对非均一性的褐藻多糖进行了结构分析,质量数的误差为0.6个质量单位,准确度为0.011%。

ESI M S不仅可以产生多电荷离子,还可以产生多电荷母离子的子离子,这样就可以获得比单电荷离子的子离子更多的结构信息,所以它可以补充或增强由FAB获得的信息,即使是小分子也是如此。那些因没有分子离子或只有nm ol级而不能用FAB检测的大分子寡糖,即使样品只有pm ol量级且未经衍生也可使用ESI M S分析。LIU Ying 等[14]以高效液相色谱 电喷雾质谱联用技术(H PLC ESI M S)对未经衍生的低聚糖进行分离及结构分析,检出限低于50pg。

此外,与FAB M S相比它还有一个显著优点,即ESI M S可分析含有羧基或硫酸根等官能团的较大寡糖链。Daniel等[15]对褐藻胶糖进行部分水解,得到的低聚糖采用ESI MS在负离子模式下进行分析,结果表明褐藻胶糖中含有硫酸化的岩藻糖,并且确定了硫酸化的位点。证实了ESI M S可以分析高度硫酸化的低聚糖。M uresan[16 17]等认为在糖胺聚糖的结构分析中,ESI MS是最有效的方法之一。

由于ESI M S能检出非衍生化的糖,且灵敏度高,无需衍生化就能区分寡糖是O-连接还是N-连接,以及寡糖的结构、组成和聚合度[18 19]。因此, ESI M S在糖的结构分析中显示出较大的优势。

1.5 基质辅助激光解吸离子化质谱

基质辅助激光解吸离子化质谱(MA LDI MS)是一项新兴的质谱技术,将溶于适当基质的样品涂布在金属靶上,用高强度的紫外或红外脉冲激光照射可实现样品的离子化。此方式主要用于可达100000Da质量的大分子分析,仅限于作为飞行时间分析器(TOF)的离子源使用,因此MALDI MS常与TOF一起称为基质辅助激光解吸离子化飞行时间质谱(MA LDI M S TOF)。在MALDI MS测定中,基质的作用是稀释样品,吸收激光能量及解离样品,基质的性质对获得理想的质谱图非常关键,因此对于不同的糖类需选择不同的基质才能获得更好的效果[20]。

M ALDI M S T OF是一种快速、准确、高灵敏度的质谱技术,其灵敏度在各类电离方式中最高。据报道,MALDI MS TOF技术使用相对简便快速,只要几分钟就可以获知寡糖的相对分子质量。

H ilz[21]等采用M ALDI M S TOF测定了黑色板栗中的木糖葡聚糖的相对分子质量,表明这是一种快速的相对分子质量测定方法。与ESI M S相比,具有快速、样品用量少等优点。Jacobs等[22]从云杉、白杨中提取水溶性半纤维素,通过M ALDI M S TOF对其进行相对分子质量的测定。Chizhova 等[10]采用M ALDI M S T OF成功地分析了海带多糖,快速而灵敏地测定了海带多糖的聚合度。M i namisaw a T等[23 24]通过对肝素的研究表明,M AL DI M S TOF在多糖的序列分析中具有潜在的优势。此外,在借助PSD(post so urce decay)方式下的折光TOF仪,MALDI MS TOF不再局限于过去的多糖相对分子质量测定,还可以提供详细的寡糖及糖复合物的结构信息。H ilz等[21]分析了板栗中的木糖葡聚糖的分枝情况,Jacobs等[22]分析了水溶性半纤维素的乙酰基的取代情况,Ghosh等[25]分析了葫芦中水溶性多糖的分枝情况。由于M ALDI M S TOF具有其它方法不可替代的优势,相信有望发展成为测定范围更广的测定高分子的相对分子质量和分布及其结构的方法。

2 色谱 质谱联用技术在糖分析中的应用

质谱法在一次分析中可提供丰富的结构信息,

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可以进行有效的定性分析,但对复杂有机化合物分析就为力了,而且在进行有机物定量分析时要经过一系列分离纯化操作,十分麻烦。而色谱法对有机化合物是一种有效的分离和分析方法,特别适合进行有机化合物的定量分析,但定性分析则比较困难。因此将两者结合的联用技术是进行复杂化合物高效分析的重要工具,也是分离科学方法中的一项突破性进展。

2.1 气相色谱 质谱联用

气相色谱 质谱联用技术(GC M S)是一种以气相色谱系统作为质谱进样系统的分离检测技术。GC M S可以提供有关单糖残基类型、链的连接方式、糖的序列和糖环形式、聚合度等多种结构信息。多糖为大分子物质,不能直接挥发,因而须将多糖降解为结构单糖或寡糖,并且将其衍生成具有易挥发,对热稳定的衍生物。在应用GC MS进行多糖的结构分析时,通常先将样品进行甲基化保护羟基,然后以完全酸水解,进而进行乙酰化得到挥发性乙酰化衍生物,再进行GC MS分析。

DAI Zhi yuan等[26]通过GC M S,对河蚌多糖进行结构分析,结果表明河蚌多糖由D 葡萄糖和D 木糖组成,其摩尔比为351,且以1!4糖苷键连接构成该多糖的主链。ZH ANG H o ng等[27]从螺蛳中提取得到两种多糖组分BPS 1和BPS 2,通过GC M S研究表明BPS 1和BPS 2的主链均是通过葡糖糖以1!4糖苷键连接构成。LIU Chun hui 等[28]对海胆黄多糖(SEP)进行结构分析,认为SEP 是以1!4糖苷键连接为主链的葡聚糖,并且每九个残基的C6位上有一个以1!6糖苷键连接的葡萄糖支链。ZH A Xue qiang[29]等对从霍山石斛中提取的多糖进行分析,表明其单糖组成为D构型,并且以1!6糖苷键连接构成主链,支链则以1!3糖苷键与主链相连。T ONG H ai bin等[30 31]采用GC M S对从茄科植物中提取的多糖进行研究,结果表明该多糖含有10种不同的糖苷键。此外,H E Yun m ian等[32 35]分别对不同来源的多糖进行结构分析,包括药用植物多糖及真菌多糖,通过对这些多糖的甲基化及GC M S分析,对它们的糖苷键的类型有了一些了解,为认识其构效关系奠定了基础。

2.2 液相色谱 质谱联用

由于GC M S不能分离不稳定和不挥发性物质,了GC M S应用,所以发展了液相色谱 质谱(LC M S)联用技术。与GC MS相比,它省去了甲基化、乙酰化等繁琐的样品前处理过程。可以同时检测糖肽的位置并且提供结构信息。Webster 等[36]从梨属植物细胞的悬浮培养液中提取胞外多糖,并通过LC M S分析了其中的糖蛋白。此外,据报道,H PLC与ESI M S联用,其灵敏度和精密度远优于常规使用的FA B MS,可分析未经衍生化的寡糖。LIU Ying[14]等将不同聚合度的低聚糖混合物(1到11个葡萄糖单位)经H PLC分离后,在ESI M S上均能被检出。H PLC ESI M S是一种快速、高灵敏度的用于分析多糖水解产物的方法,它可供生物组织微量的低聚糖及其异构体分析。张虹[37]等采用H PLC ESI M S对鮟鱇鱼皮硫酸皮肤素的二糖结构进行研究,结果表明鮟鱇鱼皮硫酸皮肤素的糖链是以艾杜糖醛酸 [1!3] N 乙酰氨基半乳糖 4硫酸( Di 4S(Ido))为主要二糖重复单位构成的,此外还含有少量的艾杜糖醛酸 [1!3] N 乙酰氨基半乳糖 6硫酸( Di 6S(Ido))和葡萄糖醛酸 [1!3] N 乙酰氨基半乳糖( Di 0S)二糖单位。

2.3 毛细管电泳 质谱联用

1987年首次报道了毛细管电泳 质谱联用(CE M S)技术,随之该项技术迅速获得认可和欢迎。CE MS在一次分析中可同时得到迁移时间、相对分子质量和碎片信息,因此它是LC M S的补充。WANG Zhan等[38]采用CE ESI MS分析脂多糖的酸降解产物。H ilz等[21]从黑色板栗中提取木糖葡聚糖,经内切葡聚糖酶降解后采用不同的分离(H PAEC,RP H PLC,CE)和鉴定(MALDI TOF M S,ESI M S n)手段,首次将CE ESI MS n应用于葡聚糖的结构分析。Zam fir等[39]采用CE ESI T OF 对含有硫酸皮肤素/软骨素的寡聚糖进行分析,鉴定了所含二糖的种类和结构。

CE MS作为常规方法尚存在以下缺点:浓度灵敏度低,不如LC M S;不是所有的CE分离模式都可方便地与MS联用;MS对CE分离缓冲溶液的较多。因此需进一步研究分离能力强的CE技术与MS相连接的可靠方法。

3 展望

多年来甲基化分析一直是多糖结构分析中质谱方法的主要手段,然而甲基化由于操作繁琐、耗时,正在逐渐地被其他新的质谱技术所代替(如M ALDI 和ESI)。相信随着质谱技术的进一步发展,结合核磁共振(NM R)等[40 42]其他仪器分析手段和各种化

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学方法,糖的结构及其构效关系可得到更深入的研究,对糖生物学的发展起到越来越重要的作用。

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