1.目的：建立细菌内毒素检查标准程序，指导规范操作。

2.范围：适用于各种供试品的细菌内毒素—凝胶法检查。

3.职责：检验人员对本规程的实施负责。

4.编制依据：2010年版《中华人民共和国药典》二部附录细菌内毒素检查法中的“凝胶法”。

5.原理：凝胶法是通过鲎试剂与内毒素产生凝集反应的原理来检测或半定量内毒素的方法。

6.程序：

 6.1试验材料与用具

6.1.1仪器与用具：

①可调式微量移液器（50～250μl、200～1000μl）；无热原头（250μl、1000μl）无热原空安瓿瓶或用经250℃干烤至少60分钟刻度吸管（1ml）、10mm×75mm试管。

②恒温水浴锅、快速混匀器、砂轮、温度计、试管架、封口膜。

6.1.2细菌内毒素检查用水：凝胶法细菌内毒素检查用水是指内毒素含量小于0.015EU/ml的灭菌注射用水。

6.1.3细菌内毒素标准品：细菌内毒素国家标准品或细菌内毒素工作标准品

6.1.4鲎试剂

6.2鲎试剂灵敏度复核：

在本检查法规定的条件下，使鲎试剂产生凝集的最低浓度即为鲎试剂的标示灵敏度，用EU/ml表示。

注意：当使用新批号的鲎试剂或试验条件发生了任何可能影响检验结果的改变时，应进行鲎试剂灵敏度复核试验。

6.2.1取细菌内毒素国家标准品或细菌内毒素工作标准品，用砂轮轻轻在要开启处划痕，用75%酒精擦净后开启。

6.2.2用可调式微量移液器或刻度吸管取定量的细菌内毒素检查用水沿细菌内毒素标准品瓶壁加入，用封口膜将瓶口封严，在旋涡混合器上混匀15分钟。

6.2.3根据鲎试剂的标示值（λ），用细菌内毒素检查用水对上述已溶解混匀的细菌内毒素工作标准品溶液进行倍比稀释，制成2.0λ，1.0λ，0.5λ,0.25λ四个浓度的内毒素标准溶液。每稀释一步均应在旋涡混合器上混匀30秒钟。

6.2.4取标示量为0.1ml的鲎试剂18支或其他标示量的鲎试剂适量，轻轻敲打瓶壁，将附着在瓶颈上的内容物弹下，用砂轮在瓶颈处划痕，用75%酒精擦净后开启。

6.2.5根据鲎试剂的标示量，用可调式微量移液器或刻度吸管取细菌内毒素检查用水适量加入各鲎试剂管中，轻轻晃动，使鲎试剂完全溶解避免产生气泡。将其他标示量的鲎试剂溶液分装至18支10mm×75mm试管中（每管0.1ml）。

6.2.6上述18支装有0.1ml鲎试剂溶液的安瓿或试管，其中16管分别加入0.1ml不同浓度的内毒素标准溶液，每一个内毒素浓度平行做4管；另外2管加入0.1ml细菌内毒素检查用水作为阴性对照。

6.2.7将各管中溶液轻轻混匀后，用封口膜封闭管口，垂直放入37±1℃恒温水浴锅中，保温60±2分钟。

6.2.8 将各管从恒温水浴中轻轻取出，缓缓倒转180°，观察：

1若管内形成凝胶，并且凝胶不变形、不从管壁滑脱者为阳性。

2管内未形成凝胶或形成的凝胶不坚实、变形并从管壁滑脱者为阴性。

注意：保温和拿取试管或安瓿的过程中应避免受到振动造成假阴性结果。

6.2.9结果计算：

6.2.9.1当最大浓度2.0λ管均为阳性，最低浓度0.25λ均为阴性，阴性对照管均为阴性，试验方为有效。

6.2.9.2按下式计算反应终点浓度的几何平均值，即为鲎试剂灵敏度的测定值（λc）：

λc=lg-1（∑X/4）（EU/ml）

式中X为反应终点浓度的对数值（lg）。

反应终点浓度是指系列递减的内毒素浓度中最后一个呈阳性结果的浓度。

6.2.10结果判断：

当λc在0.5λ~2.0λ(包括0.5λ和2.0λ)时，方可用于细菌内毒素检查，并以标示灵敏度λ为该批鲎试剂的灵敏度。

否则，该批鲎试剂判为灵敏度不合格，不可用于细菌内毒素检查。

6.3供试品溶液的制备：

6.3.1一般要求供试品溶液的pH值在6.0~8.0的范围内。对于过酸、过碱或本身有缓冲能力的供试品，需调节被测溶液或其稀释液的pH值，可使用酸、碱溶液或鲎试剂生产厂家推荐的适宜的缓冲液调节。酸或碱溶液必须用细菌内毒素检查用水在已去除内毒素的容器中配制。缓冲液必须经过验证不含内毒素和干扰因子。

6.3.2供试品内毒素限值的确定：

一般按以下公式确定：L=K/M

式中：L为供试品的细菌内毒素限值，以EU/ml、EU/mg或EU/U（活性单位）表示；

K为人每公斤体重每小时最大可接受的内毒素剂量，以EU/（kg·h）表示，注射剂K=5 EU/（kg·h），放射性药品注射剂K=2.5 EU/（kg·h），鞘内用注射剂K=0.2 EU/（kg·h）；

M为人用每公斤体重每小时的最大供试品剂量，以ml/（kg·h）、mg/（kg·h）或U/（kg·h）表示，人均体重按60kg计算，注射时间若不足1小时，按1小时计算。

按人用剂量计算限值时，如遇特殊情况，可根据生产和临床用药实际情况做必要的调整，但需说明理由。

6.3.3供试品最大有效稀释倍数（MVD）的确定：

最大有效稀释倍数是指在试验中供试品溶液被允许稀释的最大倍数，在不超过此稀释倍数的浓度下进行内毒素限值的检测。

MVD=cL/λ

式中：L为供试品的细菌内毒素限值；

     c为供试品溶液的浓度，当L以EU/ml表示时，则c等于1.0ml/ml，当L以EU/mg或EU/U表示时，c的单位需为mg/ml或U/ml。如供试品为注射用无菌粉末或原料药，则MVD取1，可计算供试品的最小有效稀释浓度c=λ/L；

    λ为在凝胶法中鲎试剂的标示灵敏度（EU/ml）。

6.4干扰试验

6.4.1进行干扰试验的条件

①当进行新药的内毒素检查试验前，或无内毒素检查项的品种建立内毒素检查法时，需进行干扰试验。

②当鲎试剂、供试品的配方、生产工艺或试验环境中发生了任何可能影响试验结果的变化时，须重新进行干扰试验。

6.4.2干扰试验的方法：

6.4.2.1使用未检出内毒素且不超过最大有效稀释倍数（MVD）的供试品溶液，按表1制备溶液A、B、C和D。

6.4.2.2按“6.2鲎试剂灵敏度复核”试验项下操作。

6.4.2.3只有当溶液A和阴性对照溶液D的所有平行管都为阴性，并且系列溶液C的结

果在鲎试剂灵敏度复核范围内时，试验方为有效。

6.4.2.4按下列公式计算系列溶液C和B的反应终点浓度的几何平均值（Es和Et）。

Es=lg-1（ΣXs/4）        

Et=lg-1（ΣXt/4）

式中Xs、Xt分别为系列溶液C和溶液B反应终点浓度的对数值（lg）。

6.4.3干扰试验结果判断：

当Es在0.5λ~2.0λ（包括0.5λ和2.0λ）及Et在0.5 Es~2.0 Es（包括0.5 Es和2.0 Es）时，则认为供试品在该浓度下无干扰作用。否则，则有干扰作用。

6.4.4若供试品溶液在小于MVD的稀释倍数下对试验有干扰，应将供试品溶液进行不超过MVD的进一步稀释，再重复干扰试验。

①可通过对供试品进行更大倍数的稀释或通过其他适宜的方法（如过滤、中和、透析或加热处理等）排除干扰。

②为确保所选择的处理方法能有效地排除干扰且不会使内毒素失去活性，要使用预先添加了标准内毒素再经过处理的供试品溶液进行干扰试验。

表1 凝胶法干扰试验溶液的制备

6.5供试品细菌内毒素检查—凝胶限度试验

6.5.1按表2制备溶液A、B、C和D。使用稀释倍数为MVD并且已经排除干扰的供试品溶液来制备溶液A和B。

6.5.2按“6.2鲎试剂灵敏度复核”试验项下操作。

表2 凝胶限量试验溶液的制备

6.5.3将各管置37±1℃恒温水浴保温60±2分钟后观察结果。

6.5.4结果判断：

若阴性对照溶液D的平行管均为阴性，供试品阳性对照溶液B的平行管均为阳性，阳性对照溶液C的平行管均为阳性时，试验有效。

1若溶液A的两个平行管均为阴性，则判供试品符合规定；

2若溶液A的两个平行管均为阳性，则供试品不符合规定；

③若溶液A的两个平行管一管为阳性，另一管为阴性，需进行复试。复试时，溶液A需做4支平行管，若所有平行管均为阴性，判供试品符合规定；否则判供试品不符合规定。

6.6供试品细菌内毒素检查—凝胶半定量试验

   本法是通过确定反应终点浓度来量化供试品中内毒素的含量。

6.6.1按表3制备溶液A、B、C和D。

6.6.2按“6.2鲎试剂灵敏度复核”试验项下操作。

6.6.3将各管置37±1℃恒温水浴保温60±2分钟后观察结果。

6.6.4若阴性对照溶液D的平行管均为阴性，供试品阳性对照溶液B的平行管均为阳性，系列溶液C的反应终点浓度的几何平均值在0.5λ~2.0λ之间，试验有效。

表3 凝胶半定量试验溶液的制备

B为2λ浓度标准内毒素的溶液A（供试品阳性对照）。

C为鲎试剂标示灵敏度的对照系列。

D为阴性对照。

6.6.5结果计算及处理：

1每个系列的反应终点浓度：系列溶液A中每一系列平行管的终点稀释倍数乘以λ。

2供试品溶液的内毒素浓度：即所有平行管反应终点浓度的几何平均值（cE）。

cE= lg-1（ΣX/2）

③若检验时采用的是供试品的稀释液，则计算原始溶液内毒素浓度时要将结果乘以稀释倍数。

④如果试验中供试品溶液的所有平行管均为阴性，应记为小于λ；如果检验的是稀释过的供试品，则记为小于λ乘以供试品进行半定量试验的初始稀释倍数。

⑤如果供试品溶液的所有平行管均为阳性，则记为内毒素的浓度大于或等于最大稀释倍数乘以λ。

6.6.6结果判断：

若内毒素浓度小于规定的限值，判供试品符合规定。

若内毒素浓度大于或等于规定的限值，判供试品不符合规定。

6.7填写相应记录。下载本文