第20卷第8期2008年8月化学研究与应用
Che m ical Research and App licati on Vol .20,No .8
Aug .,2008
收稿日期:2007212217;修回日期:2008204219
基金项目:陕西省教委专项基金资助项目(06JK166),(07JK420)
联系人简介:刘静(19622),女,副教授,研究方向:蛋白质的改性。Email:liujing163@1631com
文章编号:100421656(2008)0821028203
小分子大豆多肽的分离检测研究
刘 静
1,23
,张光华2,张海平
2
(11咸阳师范学院化学系,陕西 咸阳 712000;21陕西科技大学化工学院,陕西 西安 710021)
关键词:大豆分离蛋白;酶;多肽;毛细管电泳;凝胶渗透色谱
中图分类号:O657171 文献标识码:A
最近的研究表明,多肽特别是二肽和三肽更易被人体吸收,此外小分子大豆肽还具有很好溶解性、稳定性、低粘度和许多生理活性,如降血压,降胆固醇,抗疲劳等,因此大豆肽广泛应用在食
品、化妆品、药品等领域[1,2]
。
毛细管电泳(CE )具有高效、快速、微量的特点[3]
,热点之一[4]
。凝胶渗透色谱可以快速测定大豆多肽的相对分子质量及其分布,线性和重复性好,对于复杂蛋白质水解产物的分离分析颇具潜力。
目前常规加热法分解蛋白质已经达到很高的水解率,但要达到小分子肽阶段,费时且条件苛刻。本文尝试用微波加热双酶复合水解大豆分离蛋白,用高效毛细管电泳、凝胶色谱对大豆分离蛋白的分解物进行分离和检测,为蛋白质的分离检测工作打下基础。
1 实验部分
111 主要材料及仪器
大豆分离蛋白(新乡同飞食品有限公司,蛋白
质含量≥%);中性蛋白酶(酶活力为310×104u /g ),酸性蛋白酶(酶活力318×104u /g ),均为无锡杰能科生物工程有限公司;多肽分子量标准品(毛细管电泳专用,Amersha m B i osciences 公司);聚乙二醇分子量标准品;其余试剂均为AR 。
LG 2微波炉(900W ,经改造,LG 电子电器公司);Specord50紫外可见分光光度计(德国jena 公司);CE -212高效毛细管电泳仪(北京大学制
造);24142515型凝胶渗透色谱仪(美国W aters 公
司);真空冻干机(freez one 415美国LABCONCO 公司)。112 实验方法
分别称取一定量大豆分离蛋白,加水搅拌均匀,用稀碱调至pH810,加入中性蛋白酶,于微波
炉中间歇式加热水解[5,6]
。反应过程保持温度、pH 值恒定,数分钟后调节溶液pH315,加入酸性蛋白酶,同样方法实验,反应结束后,沸水浴中加热15m in 灭酶,冷却并于4000r/m in 的速度离心10m in,取上清液进行酶解分析。并将水解液在真空冻干机中冻干,研细置于干燥器中供检测备用。另取等量的大豆分离蛋白采用水浴加热水解,比较不同加热方式水解度变化。113 分析检测方法
11311 水解度测定[7]
甲醛滴定法(G B /T 1477121993)11312 毛细管电泳法分离 分别称取少量多肽分子量标准品、水解液冻干粉加入适量缓冲液(100mmol/L Tris/HCl +011%S DS +011%PE O ,pH 815),沸水浴中加热溶解,离心分离,取上清液经0145μm 滤膜过滤,超声脱气后在缓冲溶液中运行,于毛细管电泳中进样分析。
石英毛细管分别以高纯水、011mol/LNa OH 冲洗3m in 后,用缓冲液冲洗至基线平稳,然后以气动进样的方式进样10s,加电压10kv 运行,阴极紫外(214nm )检测。11313 交联葡聚糖凝胶G 250分级 标准曲线的绘制:准确称量胰蛋白酶(M =23300)、溶菌酶(M
=14400)、牛胰岛素(M=5700)标准品各51000mg,溶解于1mL流动相中,进样20u L于葡聚糖G250柱,用流动相洗脱,每10m in接1管(3mL),在280nm测定其吸光度,并记录所收集溶液体积,绘制吸光度2洗脱液体积曲线,由相应的洗脱峰体积与分子量对数作图。(柱参数:柱径: 2c m;填料高度:30c m)
流动相:50mmol/L三羟甲基氨基甲烷和011mol/L氯化钠(pH810/HCl)
大豆肽的分离:按同样方法实验,得到大豆多肽的分级图谱,并算出各级分相对分子量分布范围。
11314 凝胶渗透色谱法分离检测 将聚乙二醇分子量标准品用流动相配制成0101%的溶液,用0122μm滤膜过滤,超声脱气后进样,记录洗脱峰的保留时间,绘制标准品分子量对数2洗脱液体积曲线。
色谱条件:流动相:011mol/L Na NO
3
溶液,柱温35℃,进样量:20μL,流速018mL/m in
收集11313中40—90mL洗脱液,冻干后备用。取适量用高纯水浸泡过夜,按同样方法实验,用M illennium32色谱
工作站积分,得到相应分
子量。
2 结果与讨论
211 不同加热条件的比较
表1 不同加热方法水解度变化
Table1
Hydr olysis degree with variety methods of heating
常规加热微波加热
时间2/h4/h5/h6/h8/h1/m in5/m in8/m in10/m in15/m in 水解度(%)718251540441211522213334214
由表1知,大豆分离蛋白在微波复合双酶水
解15m in即可达到常规加热8h的水解度,大大缩
短了水解时间,降低能耗。这是由于酶分子与蛋
白质多肽健中相应的氨基酸残基位点发生作用,
使肽键断裂[8],采用双酶联合水解的方法,增加蛋
白质催化位点,肽键断裂部位更多[9];加之微波强
烈高频作用可使蛋白质复杂结构变得松散、伸展,
并能穿透样品内部加热,从而快速有效地将其分
解成水解度较高的小分子大豆肽。
212 大豆多肽的分离检测
21311 大豆多肽的高效毛细管电泳分离检测
大豆多肽分子量标准品的毛细管电泳图见图1。
微波双酶水解得到大豆多肽毛细管电泳图见图2。
图1 多肽分子量标准毛细管电泳图
Fig.1 Standard of pep tides in HPCE
Ⅰ2512Ⅱ6214Ⅲ8159Ⅳ10700Ⅴ14404Ⅵ16949
图2 大豆多肽毛细管电泳图
Fig.2 HPCE of pep tides
图2可以看出:微波双酶水解所得的大豆多肽大
部分保留时间在19134m in以内,且峰形,说
明分离效果良好。比较图1、2可知:微波双酶水
解所得的大豆多肽的分子量主要集中在8000D
(道尔顿)以下,远小于未水解前蛋白质分子质量
(10万以上)。可见采用微波加热和双酶复合水
解是将蛋白分解成小分子多肽的高效方法。
21312 大豆多肽的G250法分级检测[10] 由多肽
分子量标准品的吸光度2洗脱液体积所作曲线得
知洗脱峰体积与相应的标准蛋白分子量对数有良
好的线性关系,回归方程为:y=2010256+
511409,(r=019996其中x:洗脱液体积/mL;y:
分子量对数)。微波加热、双酶复合水解得到大豆
肽的吸光度2洗脱液体积曲线见图3。
9201化学研究与应用第20
卷
图3 大豆多肽的G250层析分离谱图
Fig.3 Seperating figure of sephadex G250
lay analysis f or p r p tides
由图3可知交联葡聚糖凝胶G250对微波双酶水解大豆肽的分离效果较好,分为四个级分。其中:级分①的分子量在116万以上;级分②分子量在1000210000D,级分③以后主要集中在1000以下。21313 大豆多肽的凝胶渗透色谱分离检测记录聚乙二醇分子量标准品洗脱峰的保留时间。色谱峰的保留时间t与相应分子量的对数LogM w有良好线性关系,得到线性回归方程, l ogMw=9118622011791t,r=019993。实验11314结果见图4
。
图4 大豆多肽凝胶渗透色谱图
Fig.4 GPC of nentides
由图4可知,25m in～40m in区间出现五个肽峰(40m in以后小分子峰无法积分出),峰形,分离效果好。分子量分别是12826、5269、3735、13和945D,且多数集中在小分子量阶段,与毛细管电泳检测结果一致。
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Study on sepera ti on and exam i n a ti on of low m olecule
we i ght soybean polypepti des
L IU J ing1,23,ZHANG Guang2hua2,ZHANG Hai2p ing2
(11Depart m ent of Che m istry,Xianyang Teachers’College,Xianyang,712000;
21School of Chem istry and Engineer,Shaanxi University of Science and Technol ogy,Xi’an,710021)
Abstract:Low molecular weight polypep tide was gotten by m icr owave heating and t w o kinds of enzy me hydr olysis1It was tested and seperated by high2perf or mance cap illary electr ophoresis(HPCE),gel per meati on chr omat ography(GPC)1The results showed that m icr owave heating and enzy me hydr olysis was a high effect way of hydr olysis p r otein int o l ow molecular weight polypep tide; polypep tide was well tested and seperated by HPCE,cons ociati on G250with gel per meati on chr omat ography(GPC)1
Key words:s oybean is olated p r otein;enzy me;polypep tide;HPCE;GPC
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