文章编号:1000-1638(2008)02-0166-06

一株分解纤维素的肠球菌的分离鉴定

刘占英1,2,侯先志1,刘玉承1,刘小刚1,杨　帆1,赵子夫1

(1.内蒙古农业大学动物科学与医学学院,呼和浩特010018;

2.内蒙古工业大学化工学院,呼和浩特010051)

摘要:从绵羊瘤胃内容物中分离出一株高效纤维素降解细菌.经形态学、生理生化反应和基因

型的鉴定,鉴定为肠球菌属的一个种,其16S rDN A序列(1480bp)在N CBI中的登录号为

EU106047,并将所测得的序列用Clustal W软件按N eig hbor-Joining方法构建了16S r DN A系

统发育树.

关键词:纤维素降解细菌;分离;鉴定

中图分类号:Q93-331　　文献标识码:A

　　纤维素是地球上最丰富的可再生的生物质资源,它占植物干重的35%～50%,是地球上分布最广、含量最丰富的碳水化合物,它的降解是自然界碳素循环的中心环节〔1〕.纤维素的利用与转化对于解决目前世界能源危机、粮食短缺和环境污染等问题具有十分重要的意义.自然界中存在着一些微生物能够把纤维素降解为可利用的多糖或单糖,从而使大量的纤维素资源能够得到利用.目前,对产纤维素酶的微生物研究较多的是霉菌〔2〕,对产纤维素酶细菌分离筛选的较少,但因为霉菌是好氧微生物,其培养过程中需要氧气的特性使其在环境污染等方面的应用受到了,所以研究厌氧或兼性厌氧纤维素降解菌在应用上更具有现实意义.近年来,一些学者对厌氧和兼性厌氧的纤维素降解菌进行了研究〔3,4,5〕,以扩大纤维素酶在环境污染等方面的应用.本研究最初目的是为了从以粗纤维为饲料的绵羊瘤胃内容物中分离出厌氧纤维素降解菌,但在分离的菌株中发现一株兼性厌氧的肠球菌对纤维素也具有较好的降解能力,现报道如下:

1　材料与方法

1.1　材料

1.1.1　培养基的配制

　　1)分离培养基(培养基A):羧甲基纤维素为唯一碳源的培养基,具体配方参见文献〔6〕,因为是细菌培养,将文献〔6〕培养基中的青霉素和链霉素去掉.

　　2)富集培养基和液体发酵培养基(培养基B):纤维二糖作为唯一碳源,其他成分同1.1.1.1,并去掉琼脂,做成液体培养基.

　　3)复筛培养基(培养基C):将培养基B中的纤维二糖用3片5cm×1cm的Whatman NO.1滤纸代替.

　　4)测滤纸降解率所用培养基(培养基D):将培养基B中的碳源纤维二糖用烘至恒重后球磨的Whatman NO.1滤纸代替,滤纸加量为0.5000g/100m L.

收稿日期:2007-11-14

基金项目:国家自然科学基金资助项目(30460095)

作者简介:刘占英(1979～),女,内蒙古赤峰市人,讲师,2004级博士研究生.

通讯作者:侯先志(1948～),教授,山西新县人,博士生导师.

1.1.2　样品采集:样品采自日粮精粗比为3∶7的装有永久瘤胃瘘管的绵羊.1.2　方法

1.2.1　菌种初筛:将瘤胃液样品梯度稀释到10-5倍,在CO 2保护下倒平板.将倒好的平板放在厌氧罐中于39℃培养箱中培养约24h,待平板中长出菌落,挑取有透明圈的单菌落镜检观察是否为单一菌种,若是单一菌种,留存以备复筛之用,若不是单一菌种,继续进行分离纯化.

1.2.2　菌种复筛:将初筛得到的有透明圈的单一菌种在培养基B 上39℃培养12h ,制成种子液.然后按20%的接种量将种子液接种到装有15m L 培养基C 的25m L 西林瓶中,并做不接菌的空白对照,将二者同时在39℃培养,观察接有菌液的西林瓶中滤纸的降解情况.经目测,滤纸条出现明显孔洞、分层、边缘溶解等现象的视为该菌种能降解滤纸,选出滤纸降解速度较快、滤纸降解程度较大的菌种作为复筛菌种.

1.2.3　血清瓶产酶实验:将复筛得到的菌种接种到装有50m L 培养基B 的150m L 血清瓶中,于39℃条件下培养48h .培养结束后,取发酵液进行滤纸酶活力和羧甲基纤维素酶活力的测定.1.2.4　酶活力测定

　　1)滤纸酶活力(FPA)测定:将1.5m L 的0.1m ol /L pH6.8的磷酸缓冲液加入25m L 的带塞试管中,在其中加入1×5cm Whatman No.1滤纸1条,再在试管中加入0.5m L1.2.3中得到的粗酶液,将试管放入50℃水浴中保温60min ,然后立即加入1.5m L 1.0%(w /v )的DN S 试剂终止反应.还原糖测定通过DNS 试剂法测定〔7〕,滤纸酶解后的总还原糖减去发酵液中原有的还原糖即为滤纸酶解产生的还原糖.

　　2)羧甲基纤维素酶(CM Case )活力测定:用0.1m ol /L pH 6.8的磷酸缓冲液制备1%的CM C -Na 溶液,取1.5m L 的此CM C -Na 溶液加入到25m L 的带塞试管中,在其中加入0.5m L 1.2.3中得到的粗酶液,将试管放入50℃水浴中保温30min,然后立即加入1.5m L 1.0%(w /v )的DN S 试剂终止反应.还原糖测定通过DNS 试剂法测定〔7〕

,羧甲基纤维素酶解后的总还原糖减去发酵液中原有的还原糖即为羧甲基纤维素水解产生的还原糖.

　　3)酶活力单位:将上述条件下每分钟由底物产生1μmo l 葡萄糖所需的酶量定义为一个酶活力单位,用IU /m L 表示.1.2.5　滤纸降解率测定:将在西林瓶中用培养基B 培养的处于对数生长期的菌液接种到装有100

m L 培养基D 的150m L 血清瓶中(接种量20

%),39℃培养7d 和14d 后分别测定滤纸降解率.1.2.6　菌种鉴定:参照《常见细菌系统鉴定手册》〔8〕和《伯杰氏细菌系统鉴定手册》(第九版)〔9〕.1.2.7　菌种的16S rDN A 序列测定

　　1)基因组DN A 的提取:采用珠磨-SDS /CT AB /PV P 法〔10〕.　　2)16S r DN A 的PCR 扩增:

引物:采用Ta Ka Ra 16S rDN A Bacterial Identification PCR Kit 中的扩增引物扩增供试菌的16S rDN A 片段.

PCR 反应体系组成:模板DN A (浓度为100ng /μL )1μL ,PCR 预混液(含Taq 酶,Buffer ,dN TP ,Mg 2+

)25μL ,正反引物各0.5μL ,无菌水补足体系50μL .做阴性对照和阳性对照时分别用1μL H 2O 或1μL 阳性对照DN A(1100bp)代替模板DN A.

PCR 反应条件:按表1条件进行PC R 反应.

　　PCR 扩增目的片段后,取5μL 由模板DN A 扩增的PCR 产物、阳性对照的PCR 产物和阴性对照的PCR 产物进行琼脂糖凝胶电泳,通过电泳观察所扩增的目的片段的长度,通过阴性对照检测PCR 反应体系是否有细菌污染,通过阳性对照防止假阴性的出现.

　　3)PCR 产物纯化:取40μL PC R 产物进行琼脂糖凝胶电泳,使用Ta Ka Ra Ag arose Gel DN A Purification Kit Ver .2.0切胶回收目的片段,取切胶回收的目的片段1μL ,检测纯化产物的浓度和大小.

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第2期刘占英等　一株分解纤维素的肠球菌的分离鉴定

表1　PC R 反应条件

Table 1　Reaction condition f or PCR

温度(℃)

时间(min)

循环数

Step 1预变性9451变性

941Step 2复性55130延伸72 1.5Step 3

延伸

72

5

1

　　4)16S rDN A 序列测定:用ABI PRISM TM 3730X L DN A 测序仪对纯化得到的PCR 产物进行DN A 测序(测序委托宝生物工程(大连)有限公司完成).测序结果与Genba nk 中已知种属的16S rDN A 序列进行比较.

1.2.8　电镜研究:将分离菌株在培养基B 上培养12h 至指数生长期,取培养物进行负染色,

然后用透射电镜观测和拍摄.

2　结果与分析

2.1　菌种筛选

2.1.1　初筛结果:经菌落观察和革兰氏染色,图1平板中的菌落1至6均为单菌落,且都能在羧甲基纤维素为唯一碳源的平板上产生透明圈,将菌落1至6作为初筛得到的菌种.2.1.2　复筛结果:对初筛得到的6个菌落进行滤纸降解情况测定,选出对滤纸降解速度较快的菌株作为复筛菌株.经过2周培养,目测发现菌落1、2、3、5、6对应的菌株能使滤纸产生孔洞和边缘溶解,其中从菌落1上挑取的菌对滤纸降解速度最快,且将滤纸降解的程度最大,将其

命名为CTB374-1,作为复筛得到的菌种.

图1　初筛菌种所用平板

Fig .1　Plate fo r primar y selection of st rain 2.1.3　复筛菌株的酶活力:复筛得到菌株的滤纸酶活力和羧甲基纤维素酶活力见表2(表中数据为3

次测定数据的平均值).

表2　复筛菌株的滤纸酶活力和羧甲基纤维素酶活力

Table 2　Filter paper enzyme activity and C MCase activity of selected strain

菌种滤纸酶活力[IU /ml ]

羧甲基纤维素酶活力[IU /ml ]

CT B374-1

0.87±0.07

4.3±0.2

2.1.4　复筛菌株的滤纸降解率:复筛得到菌株的滤纸降解率见表3(表中数据为3次测定数据的平均值).

表3　复筛菌株滤纸降解率

Table 3　Filter paper disappearance of selected strain

菌种1周滤纸降解率(%)

2周滤纸降解率(%)

CT B374-1

16.5±1.5

24.0±0.8

2.2　菌种鉴定2.2.1　形态特征

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内蒙古大学学报(自然科学版)2008年

　　1)菌体形态特征:C TB374-1的菌体形态特征见图2.

2)菌落形态特征:C TB374-1菌在羧甲基纤维素钠上生长的菌落形态特征见图1中的菌落1.

2.2.2　生理生化特征:菌株CTB 374-1的生理生化特征结果见表4.

2.2.3　遗传型的鉴定:

　　1)16S r DN A 基因的PCR 扩增:通过PCR 反应扩增目的片段.将扩增后的目的片段和阳性、阴性对照片段同时进行琼脂糖凝胶电泳,结果见图3.目的片段切胶回收纯化后的琼脂糖凝胶电泳见图4.

图2　CT B374-1透射电镜照片(3000倍)

Fig .2　Tr ansmission elect ro n micro sco pe fo r CT B 374-1

表4　生理生化特征

Table 4　Physiology and biochemistry characteristic

项目结果项目结果革兰氏染色

+发酵类型兼性厌氧发酵糖醇产酸:

温度试验:

葡萄糖+10℃+甘露醇+20℃++乳糖+30℃+++L -阿拉伯糖-37℃#棉籽糖+39℃++山梨醇+45℃+水杨苷+p H 试验:麦芽糖+ 6.3++蜜二糖+ 6.8#果糖+7.8+甘油-9.6+七叶苷+ 6.5%N aCl +乳酸钠-接触酶-半乳糖+盐还原-D-木糖+H 2S 合成-纤维二糖+运动性

-

纤维素+发酵主要产酸

乳酸

　　注:上表中“#”表示同一株菌在不同温度或不同pH 值条件下产生沉淀最多者或混浊度最大,“+++”“++”“+”依次递减;“+”阳性,“-”阴性.

　　由电泳图可见,扩增得到的目的片段长约1.5kb 左右,PCR 反应体系无细菌污染.　　2)16S r DN A 系统发育分析:

经宝生物(大连)公司序列测定,确定扩增的16S rDN A 片段长度为1480bp ,Blastn 比较序列发现该菌株的16S r DN A 序列与多株肠球菌属细菌的16S rDN A 相似,故Genbank 命名为Enterococcus sp .C TB 374-1(Genbank 登录号为EU 106047).调出其中已鉴定菌株的16Sr DN A ,用ClustalW 进行多重序列对比,并按N eighbor -Joining 法构建系统发育树(图5).

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第2期刘占英等　一株分解纤维素的肠球菌的分离鉴定

3　讨　论

　　本研究所筛选的纤维素降解细菌,具有较高的纤维素降解能力和纤维素酶活力,经生理生化鉴定和遗传型的鉴定,鉴定为肠球菌属的一个种,说明有些肠球菌存在纤维素酶基因,能降解纤维素,这与

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内蒙古大学学报(自然科学版)2008年

Celine Ro ber t(2003)〔11〕

的报道一致,Celine Robert(2003)从人的大肠中也分离到了能降解纤维素的

肠球菌,且该菌也与Enteroc occus f aecalis 的相似度极高.对本研究所筛选肠球菌的纤维素酶和纤维素酶基因的研究有待进一步深入.

致谢:感谢内蒙古农业大学乳品生物技术与工程教育部重点实验室提供的帮助.

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(责任编委　杨　持)

Isolatio n and Identification o f a St rain

Celluloly tic Enterococcus sp .CTB 374-1

LIU Zhan-ying

1,2

,HOU Xia n-zhi 1,LIU Yu-cheng 1,LIU Xiao-gang 1,Y ANG Fa n 1,ZHAO Zi-fu

1

(1.College of Animal Science and Animal Medicine ,

Inner Mongolia Agricultural University ,Hohhot 010018,China ;

2.College of Chemical Engineering ,

Inner Mongolia Univ ersity of Technology ,Hohhot 010051,China )

　　Abstract :A strain o f celluloly tic bacterium deg rading fibre w as effectively iso lated from the rum en of the sheep.By identificatio n o f mo rpholog y,phy siolog y and bio chemistry characteristics,and genotype,the isolate belo ng ed to the g enus Enteroc occus .The Accessio n Number of the 16S rDN A (1480bp )gene sequence is EU 106047in NCBI .The 16S r DN A phylo genetic tree w as constructed by clustal W softwa re using the Neighbo r-Joining method.

Key words :celluloly tic bacterium ;sepa ra tio n ;identification

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第2期

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