考马斯亮蓝c—250染色法
一、原理
考马斯亮蓝G-250（Coomassie brilliant blue,G-250）法是利用蛋白质典料结合的原理，
定量地测定微量蛋白质浓度的快速、灵敏的方法。
考马斯亮蓝G-250存在着两种不同的颜色形式，红色和蓝色。它和蛋白质通过范德瓦
尔镶结合，在一定蛋白质浓度范围内，蛋白质和染料结合符合比尔定律。此染料与蛋白质结
合后颜色由红色形式转变成蓝色形式，最大光吸收由460nm变成595nm，通过测定595M赴光吸收的增加量可知与其结合蛋白质的量。
蛋白质和染料结合是一个很快的过程，约2min即可反应完全，呈现最大光吸收，并可稳定1h，之后，蛋白质-染料复合物发生聚合并沉淀出来。此法灵敏度高(比Lowry法灵敏4
倍)，易于操作，干扰物质少，是一种比较好的定量法。其缺点是在蛋白质含量很高时线性偏低，且不同来源蛋白质与色素结合状况有一定差异。
二、实验材料、试剂与仪器设备
1．实验材料
植物材料。
2．试剂
(1)标准蛋白质溶液(100µg/ml牛血清白蛋白) 称取牛血清蛋白25mg，加水溶解并定容至l00ml，吸取上述溶液40ml，用蒸馏水稀释至100ml即可。
(2)考马斯亮蓝试剂 称取100mg考马斯亮蓝G-250，溶于50ml 90％乙醇中，加入100ml 85％(W/A)的磷酸，再用蒸馏水定容到1000ml，贮于棕色瓶中。常温下可保存1个月。
3．仪器设备
分光光度计，离心机，研钵，烧杯，量瓶，移液管，试管等。
三、实验步骤
1．标准曲线的绘制
取6支试管，按表26-1加入试剂，摇匀，向各管中加入5ml考马斯亮蓝试剂，摇匀，并放置5min左右，以0号试管为空白对照，在595nm下比色测定吸光度。以蛋白质含量为横坐标，以吸光度为纵坐标绘制标准曲线。
2．样品测定
(1)样品提取。称取鲜样0.25g—0.5g，用5ml蒸馏水或缓冲液研磨成匀浆后，3000r/min离心10min，上清液备用。
(2)吸取样品提取液1.0ml(视蛋白质含量适当稀释)，放入试管中(每个样品重复2次)，加入5ml考马斯亮蓝试剂，摇匀，放置2min后在595nm下比色，测定吸光度，并通过标准曲线查得蛋白质含量。
表26-1 绘制标准曲线的各试剂加入量
| 试剂 | 管号 | |||||
| 0 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | |
| 标准蛋白质（ml） | 0 | 0.2 | 0.4 | 0.6 | 0.8 | 1.00 |
| 蒸馏水量（ml） | 1.00 | 0.8 | 0.6 | 0.4 | 0.2 | 0 |
| 蛋白质含量（µg） | 0 | 20 | 40 | 60 | 80 | 100 |
样品中蛋白质含量的计算=C×VT/VS×WF×1000(mg/g)
式中：
C—查标准曲线值，µg。
VT—提取液体积，ml。
VS—测定时加样量，ml。
WF—样品鲜重，g。下载本文
