注意：本步骤为间接ELISA步骤

一 主要步骤

1 包被

取所要包被的物质，提前设计好所需浓度，根据包被孔数计算所需包被物的量，用包被液稀释至所需体积，分加至各孔中。

包被条件：两种选择：一是将ELISA板直接置4℃过夜；也可以先置37℃孵育2小时再转入4℃过夜。

2 洗涤

    包被结束后弃掉包被液，用PBST进行洗涤，方法为PBST加满每孔，静置5-10min，弃掉洗液，重新加满，重复洗涤3-5次，最后拍干ELISA板等待下一步封闭。

3 封闭

常用10%小牛血清，取第2步的ELISA板加封闭液至每孔，体积至少为所加包被液的两倍。封闭条件也有两种选择：直接置于4℃过夜，或者置于37℃温育2-4h，具体何种条件不同物质的ELISA可能不同。

4 洗涤

封闭结束的ELISA板进行洗涤，方法同步骤2。最后拍干等待加入一抗。

5 加入一抗

一抗即为你要检测的物质，一般加之前需要稀释，具体稀释倍数不同实验 不同需要自己摸索。一抗样品一般用包被液稀释，稀释到所需浓度后加入到相应孔中。反应条件为37℃孵育2h。

6 洗涤

具体同步骤4。

7 加相应HRP-标记的商品化二抗

加相应的商品化HRP-标记的二抗（如一抗为鼠源物质则对应加抗鼠二抗），一般也用封闭液稀释，稀释倍数参考二抗说明书。将稀释好的二抗加入各孔，37℃反应1-1.5h。

8 洗涤

具体同步骤4。

9 显色

常用OPD作为显色底物，但OPD致癌，也有用TMB作为底物，这里只介绍前者。显色需要配置显色液，具体方法为：在步骤8进行到一半使配置显色液，为10ml底物缓冲液加0.015g OPD粉末（实际操作由于OPD有毒不方便称量故只需稍微加入一点即可），等待OPD完全溶解。待步骤8完成后取150ul 3%过氧化氢溶液加入之前配置的10ml溶液中混匀，立即将此显色液分加至ELISA各孔中。然后将ELISA板置于37℃反应约10min。

10 终止

    将ELISA板取出，每孔加终止液（2mol/L硫酸溶液）终止反应，立即到酶标仪上读数（OPD为底物是读数波长为490nm，TMB为底物时波长为450nm）。

二 材料、试剂

1 ELISA板

专用于EILSA的产品称为ELISA板，国际上标准的微量滴定板为8×12的96孔式，需要购买。常用聚苯乙烯和聚氯乙烯材料。注意：聚苯乙烯材料目前只有进口，特点是孔大，加满约300ul，此时实验中所加各试剂（包被液、一抗、二抗、显色液、终止液等）均为100ul体积。而聚氯乙烯多为国产，孔较小，加满约200ul，此时各试剂只需加50ul体积即可。

2 各试剂配制

1）包被液（PH6.3的碳酸盐缓冲液）

无水Na2CO3  0.1696g

NaHCO3      0.2856g

SW       100ml

完全溶解至4℃,一周内使用

2）PBST配方

    NaCl          8.0g

Na2HPO4.12H2O   2.9g

KCl               0.2g

KH2PO4        0.24g

TW-20         0.5ml

SW            1000ml 

3)底物缓冲液

Na2HPO4      3.682g

柠檬酸          1.02g

DW            200ml

不需灭菌，4℃保存

4）3% H2O2 

    30%H2O2   100ml

SW        900ml

5）显色剂

底物缓冲剂   10ml

3%H2O2     150ul

OPD        15mg

其中H2O2 最后加

6）终止液

浓硫酸：SW = 1:8

浓硫酸缓慢加入到SW 中，并搅拌散热

三 注意事项

1 包被

所谓37℃反应，一般取一个37℃的水浴锅，在水面放一较大泡沫板，将ELISA板置于泡沫板上即可，其余步骤的37℃反应操作同此；

整个ELISA过程中所有需要较长时间等待的步骤（包被、封闭、加一抗孵育、加二抗孵育）均需要将ELISA包起来再放入冰箱或水浴锅中，一般可直接用一次性EP手套套起来即可。

2 洗涤

最常规的洗涤步骤是洗涤3次，每次间隔5min，具体实验可能会微调，洗涤次数可以3-6次不等，间隔5-10min不等；

每次洗涤后要将ELISA板尽可能拍干后在进行下一步操作，尤其是每个洗涤步骤的最后一次洗涤要尽可能拍干，拍干可在纱布、吸水纸上进行，也可以购买洗板机。

3 显色

配制显色液时3%过氧化氢一定要最后加入，加入混匀后立刻分装到ELISA板中，即在加过氧化氢前要完全完成洗涤的操作；

OPD一般在倒数第二次洗涤前加入，要留有约10min时间以确保OPD完全溶解。

其他未尽事宜可查阅相关资料。下载本文