一、RNA的提取
1. 提取RNA前将洗净干燥的瓷研钵放入-70℃预冷10 min；
2. 从液氮罐中取出样品组织放入预冷的研钵中，加液氮淹没后立即研磨，边研磨边加液氮，整个过程都不要使液氮挥干；
3. 趁冷，将样品粉末50-80 mg加入1.5 mL离心管后再加入1 mL Trizol，样品体积应不超过所使用Trizol体积的10%，然后按照Trizol试剂盒说明操作；
4. 室温静止5-15 min。对于某些蛋白、多糖或脂含量很高的细胞或组织Trizol裂解后可能会有不溶物或油脂状漂浮物，需12000g、4℃离心10 min，然后吸取澄清的Trizol裂解产物至一新的离心管中；
5. 每mL Trizol中加0.2 mL氯仿。小心盖上离心管，剧烈地涡旋振荡15 sec，室温（24℃）静置3-5 min；（必需步骤）
6. 12000 g、4℃离心15 min，此时混合物分成三部分：底层为苯酚-氯仿层，中间层，上层水相层，RNA完全存在水相中；
7. 把小于80%的水相层（每mL Trizol约可吸0.5-0.55 mL）转移至一新的离心管中，并弃去下面的有机相（小心避免吸到中间层）。往水相中加入异丙醇来沉淀RNA，每使用1 mL Trizol，便加500 uL的异丙醇，颠倒混匀，室温下孵育样品10 min；
8. 4℃、12000 g离心样本10 min弃去上清，每mL Trizol加入1 mL 75%乙醇，涡旋混匀，室温沉淀10 min后，7500 g、4℃离心5 min，弃上清。再用离心机甩一下（5000rpm，离心1 s）；
9. 小心吸走乙醇，短暂地在室温下置2-5 min，让RNA团风干，不要用离心干燥装置或真空干燥装置，因为过度干燥会导致很难用水重新溶解RNA，然后在55-60℃温浴10 min，然后-70℃保存。
[RNA]（ng/uL）=A260×40×稀释倍数 [DNA]（ng/uL）=A260×50×稀释倍数
纯DNA：OD260/OD280≈1.8（＞1.9，表明有RNA污染；＜1.6，表明有蛋白质、酚等污染）
纯RNA：1.7＜OD260/OD280＜2.0（＜1.7时表明有蛋白质或酚污染；＞2.0时表明可能有异硫氰酸残存）
二、M-MLV RT反转录
1. oligo dT 1 uL + dNTP（2.5 mM）4 uL + 1-5 ug total RNA + 水 = 12 uL
Heat mixture to 65℃ for 5 min and quick chill on ice；
2. 上述12 uL液体 + 5×Buffer 4 uL + 0.1 M DTT 2 uL + RNase OUT 1 uL
Mix contents of the tube，incubate at 37℃ for 2 min
3. 上述19 uL液体加M-MLV RT 1 uL
Incubate tube at 25℃ for 10 min；Incubate 50 min at 37℃；70℃ for 15 min。
三、PCR反应
1. 第一轮PCR（25 µL体系）
| 10×Buffer: | 2.5 µL |
| MgCl2(25 mM): | 1.5 µL |
| dNTP (2.5 mM): | 1 µL |
| rTaq(5 U): | 0.25 µL |
| Primer F(10 µM): | 1.0 µL |
| Primer R(10 µM): | 1.0 µL |
| 1st cDNA template: | 5.0 µL |
| Adding ddH2O: | 12.75 µL |
| 10×Buffer: | 2.5 µL |
| MgCl2(25 mM): | 1.5 µL |
| dNTP (2.5 mM): | 2.0 µL |
| rTaq(5 U): | 0.25 µL |
| Primer F(10 µM): | 1.0 µL |
| Primer R(10 µM): | 1.0 µL |
| 1st PCR template: | 1.0 µL |
| Adding ddH2O: | 15.75 µL |
3. 根据第二轮PCR结果，看效果进行4管25 µL体系PCR，然后做胶回收，（小板约45 mL胶即可）。
四、胶回收
100 µL PCR产物在1.5％琼脂糖凝胶上电泳。待目标带分离较好时，用洁净刀片切下目标条带所在胶块，尽量切去多余的胶（紫外灯下30 s内，防止DNA变性），置于灭菌的1.5 mL离心管中。用Agarose Gel DNA Extraction Kit试剂盒回收目标带，具体回收过程如下：
1. 估计胶块体积，按照0.1 g胶块加500 μL溶胶液的比例加入溶胶液，55℃-60℃溶胶约10 min，其间偶尔摇动至胶块完全溶解；
2. 胶块完全溶解后将溶胶液转移至吸附柱中，室温12 000 r/min，离心30 s，去掉废液；（最好等溶胶液温度降至室温后过柱，因为吸附柱在较高温度时结合DNA的能力较弱）
3. 向吸附柱中加入500 μL漂洗液（Wash buffer），室温12 000 r/min，离心30 s，去掉废液；
4. 重复步骤3，倒掉废液后空管室温12 000 r/min，离心2 min以完全去除漂洗液；
5. 将吸附柱转移至一干净的1.5 mL离心管中，向吸附柱膜加入30-50 μL的去离子水（一般先在65-70℃水中水浴），室温放置1-2 min，12 000 r/min，离心2 min洗脱DNA。
五、连接反应
在PCR扩增的过程中，TaqDNA聚合酶具有在双链DNA 3’末端加上一个非模板来源的核苷酸A的特性，使扩增产物具有A突出末端。将PCR产物与含有T末端的pMD18-T载体连接，就可以完成PCR产物的克隆。连接反应体系如下：
| pMD18-T Vector | 0.5 L |
| Ligate Mix | 5 L |
| 胶回收DNA | 4.5 μL（看DNA的浓度） |
| 灭菌水 | up to 10 L |
六、感受肽的制备及转化（CaCl2法）
1. 用接种环直接取冻存的TOP10在LB培养基平板上划线，于37℃培养16 h活化菌株；
2. 挑取一个单菌落于20 mL LB培养基中，37℃、250 r/min过夜培养；
3. 吸取1 mL过夜培养液于100 mL LB培养基中，37℃、250 r/min培养2 h，至OD590=0.375；
4. 将培养液转入两个预冷的50 mL灭菌离心管中，在冰上放置15 min，然后4℃、2 000×g离心7 min；
5. 弃上清，加入10 mL预冷的0.1 mol/L的CaCl2溶液悬浮细胞，同时两管合并成一管；
6. 4℃、1 600×g离心5 min，弃上清，用8 mL 0.1 mol/L的CaCl2溶液悬浮细胞，然后转入10 mL灭菌离心管中（千万不要涡旋，用头轻轻地吸吹），冰浴过夜保存。
7. 将保存在10 mL 离心管中的感受态细胞用预冷的1 mL头吸掉上清液，剩2 mL时，用预冷的200 μL头吸至1 mL时，用头混匀，然后吸取100 μL于预冷的1.5 mL离心管中作连接；
8. 再在离心管中加入10 μL连接物，用头轻轻吹打混匀，冰上放置30min；
9. 42℃水浴热激90 s，不要摇动管子，然后迅速放于冰上冰浴2 min；
10. 加入800 μL室温LB培养基，轻轻混匀，37℃、150 r/min振荡培养1.5 h；
11. 取培养菌液50 μL涂布于预先已准备的Amp/LB/X-gal/IPTG平板，室温下吸收后，倒转培养皿在37℃培养16～18 h。（100 mL LB固体培养基加100 μL 50 mg/mL 的Amp贮存液，每个平板倒好后涂40 μL的X-gal和4 μL的IPTG）
七、阳性克隆筛选
蓝色菌落为阴性菌落，白色菌落虽大多数为阳性菌落，还需PCR进一步验证。挑取单个白色菌落，重悬于10 μL灭菌水中，以此菌液为模板，PCR检测T载体中是否插入目的片段。
八、重组菌落培养及测序
在筛选出来的阳性克隆菌液中挑取3个接种于20 mL LB液体培养基中（Amp，100 μg/mL），37℃、250 r/min振荡培养16-18 h后，取菌液800 L装于1.5 mL灭菌离心管，加终浓度为20%（20 L）甘油，保存于-80℃。（为了准确起见，也可直接用菌液作为模板，进行PCR检测）
阳性克隆菌液送生物技术公司测序。下载本文
