一、实验目的

实验原理：酚氯仿法：先从全血中分离白细胞，再通过蛋白酶K 消化，通过酚、氯仿的抽提,使DNA进入水相与蛋白质成分分开，在RNase作用下，降解RNA以纯化DNA。

蛋白酶K的重要特性是能在SDS和EDTA乙二胺四乙酸二钠存在下保持很高的活性。在匀浆后提取DNA的反应体系中晶SDS可破坏细胞膜、核膜晶并使组织蛋白与DNA分离晶EDTA则抑制细胞中Dnase的活性 而蛋白酶K可将蛋白质降解成小肽或氨基酸晶使DNA分子完整地分离出来。 氯仿-异戊醇溶液可以使核蛋白变性沉淀晶将核酸物质萃取出来 再向萃取液中加入适量乙醇晶可使DNA析出。氯仿异戊醇抽提和乙醇沉淀方法在DNA纯化研究中非常常用晶氯仿-异戊醇抽提的原理是晶氯仿可使蛋白质变性并加速有机相与液相分层 异戊醇有助于消除抽提过程中产生的气泡。而DNA不溶于乙醇等有机溶剂晶因此可以通过乙醇沉淀来纯化和浓缩DNA

二、实验用品

试剂：

1mol/L(M)Tris-Cl(pH8.0),    0.5M EDTA（pH8.0），5M NaCl

TES（15mM    Tris,    15mM EDTA，    15mM NaCl）

Tris饱和酚（PH8.0）

氯仿/异戊醇（V/V=24/1）

10％SDS

5mg/ml Protease K 

70％乙醇、无水乙醇

TE缓冲液（pH8.0）：10mM Tris-Cl（PH8.0）        

1mM     EDTA(PH8.0)

        10mg/mL 溴化乙锭（EB）

耗材：

仪器：低温离心机、移液一套，低温冰箱，恒温水浴锅、紫外分光光度计（Eppendorf）。

三、实验步骤

4.1取血样：实验人员相互取血样5ml.（用品：采血管、采血针、无水乙醇、棉签、橡皮管、废液缸）

4.2血液样品的预处理：分取2ml 血样加入到离心管A中用于酚氯仿法提取DNA。

1) 破除RBC：

用移液器将采血管中剩余的3ml血样中的血凝块取出转移到组织匀浆器中研磨粉碎，再移入50ml 离心管B中，再加入5倍体积无菌水，颠倒混匀，冰上静置十分钟，用于试剂盒法提取DNA。同样方法破除离心管A中的红细胞。

2）离心管A：4℃，3000rpm，离心10min，弃上清，留沉淀，重复低渗、离心处理一次。

3）离心管A：加入30ml 生理盐水，上下轻轻混匀以重新悬浮、洗涤WBC沉淀，4℃，3000rpm，离心10min，弃上清，留沉淀。转移到１．５ｍｌ离心管中。（注意尽可能将上清弃净，同时不要丢失WBC沉淀）

4）用Protease K消化WBC：

在离心管中加入4ml TES，立即用移液器吹打，将细胞团块吹散。

加入100%SDS 350 ul，5mg/ml Protease K 100ul，充分混匀，65℃消化6 h。

４．２试剂盒法提取ＤＮＡ

１）向离心管B加入3倍体积的Buffer RBL 轻轻涡旋或颠倒混匀，3000rpm离心10min，小心弃上清，留沉淀。

２）向沉淀中加入400ul Buffer GR，并转移到1.5ml离心管中，混匀；在此基础上加入40ulProteaseK，混匀；再加入400ul Buffer GL ，颠倒混匀，剧烈旋涡震荡一分钟。

３）用塑料膜密封离心管管口，放入恒温箱中70℃10min，（延长孵育时间）至溶液清亮。

４）加入400ul无水乙醇，颠倒混匀，4℃，3000rpm，离心1 min。

５）将上步所得溶液加入到已装入收集管（Collection Tube）的吸附柱（Spin Column DL）中，8000g离心1min，弃废液，将吸附柱重新放回收集管中。

６）向吸附柱中加入500ul BufferＧＷ１（使用前检查是否加入无水乙醇），１００００ｒｐｍ离心１ｍｉｎ，弃废液，将吸附柱重新放回收集管中。

７）向吸附柱中加入500ul BufferＧＷ２（使用前检查是否加入无水乙醇），１００００ｒｐｍ离心１ｍｉｎ，弃废液，将吸附柱重新放回收集管中。

８）再次１００００ｒｐｍ离心２ｍｉｎ，弃废液，将吸附柱置于室温数分钟，以彻底晾干。

９）将吸附柱置于一个新的离心管中，向吸附柱的中间部位悬空加入５０ｍｌＢｕｆｆｅｒＧＥ，１００００ｒｐｍ离心一分钟，收集ＤＮＡ溶液，－２０℃保存。

４．３酚氯仿法法ＤＮＡ提取

１）消化６ｈ后的细胞悬液中加入等体积的Ｔｒｉｓ饱和酚，上下轻轻颠倒混匀，冰浴静置１０ｍｉｎ，４℃，３０００ｒｐｍ，离心１０ｍｉｎ。

２）将上层水相转移到一个新的离心管中，加入等体积的Ｔｒｉｓ饱和酚，上下轻轻颠倒混匀，冰浴静置１０ｍｉｎ，４℃，３０００ｒｐｍ，离心１０ｍｉｎ。

３）将上层水相转移到一个新的离心管中，加入等体积的氯仿／异戊醇（体积比２４:１），上下轻轻颠倒混匀，冰浴静置１０ｍｉｎ，４℃，３０００ｒｐｍ，离心１０ｍｉｎ。

４）将上层水相转移到一个小烧杯中，加入２．５倍体积的无水乙醇，冰上放置３０ｍｉｎ，可见网状ＤＮＡ白色沉淀析出，轻旋小烧杯，网状ＤＮＡ聚集成团。

５）用ｔｉｐ头将ＤＮＡ捞出，放入１．５ｍｌ的Ｅｐ管中，用预冷的７０％乙醇洗涤一次，４℃，１００００ｒｐｍ，离心１０ｍｉｎ，弃上清，放入－２０℃中用吸水纸片盖住Ｅｐ管口，过夜干燥。

６）加入５０ｕｌＴＥ溶液！！！！下载本文