氮蓝四唑法
一、原理
超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)普遍存在动、植物的体内，是一种清除超氧阴离子自由基的酶，它催化下面的反应：
反应产物H2O2可由过氧化氢酶进一步分解或被过氧化物酶利用。超氧化物歧化酶抑制氮蓝四唑(NBT)在光下的还原作用来确定酶活性的大小。在有氧化物质存在下，核黄素可被光还原，被还原的核黄素在有氧条件下极易被氧化而产生超氧阴离子，超氧阴离子可将氮蓝四唑还原为蓝色的甲腙，后者在560nm处有最大吸收。而SOD可清除超氧阴离子，从而抑制了甲腙的形成。于是光还原反应后，反应液蓝色愈深，说明酶的活性愈低，反之酶的活性俞高。据此可计算出酶活性的大小。
二、材料、仪器设备及试剂
(一)材料
植物器官(花瓣、叶片等)
(二)仪器设备
冰箱、低温高速离心机、微量加样器 (1mL、20μL、100μL)、移液管、精密电子天平、UV-752型紫外分光光度计、试管、研钵、剪刀、镊子、荧光灯(反应试管处照度为4000Lux或Lx)
(三)试剂
(1) 0.05mol/L磷酸缓冲液(PH7.8)。
(2) 130mmol/L甲硫氨酸(Met)溶液：称1.9399gMet用磷酸缓冲液定溶至100mL。
(3)750μmol/L氮蓝四唑溶液：称取0.06133gNBT用磷酸缓冲液定溶至100mL，避光保存。
(4)100μmol/LEDTA-Na2溶液：称取0.03721g EDTA-Na2，用磷酸缓冲液定溶1000mL。
(5)20μmol/L核黄素溶液：称取0.0753g核黄素用蒸馏水定溶到1000mL，避光保存。
三、试验步骤
(一)酶液的提取
(1)称取植物材料(去叶脉)0.2g，加1ml预冷的磷酸缓冲液在冰浴上研磨成浆，加缓冲液使体积为5mL。取2mL于1000r/min下离心20min，上清液即为SOD粗提液。
(二)显色反应
取5mL的试管(要求透明度好)若干，有对照、处理。按下表加样：
| 试剂(酶) | 用量/mL | 终浓度/比色时 |
| 0.05mol/L磷酸缓冲液 | 1.5 | |
| 130mmol/Lmet溶液 | 0.3 | 13mmol/L |
| 750μmol/LNBT溶液 | 0.3 | 75μmol/L |
| 100μmol/L EDTA-Na2液 | 0.3 | 10μmol/L |
| 20μmol/L核黄素 | 0.3 | 2.0μmol/L |
| 酶液 | 0.05 | 对照液用缓冲液 |
| 蒸馏水 | 0.25 | |
| 总体积 | 3.0 |
(三)SOD活性测定与计算
至反应结束后，以不照光的对照管做空白，分别测定其他管的吸光度。
四、计算酶活力
已知SOD活力单位以抑制氮蓝四唑光还原的50%为一个酶活力单位表示，按下式计算SOD活性。
SOD总活力=[(ACK-AE)×V]/(0.5×ACK×W×Vt)
SOD比活力= SOD总活力/蛋白质含量
公式中：SOD总活力以鲜重酶单位每克表示；比活力单位以酶单位每毫克蛋白表示；ACK为照光对照管的吸光值；AE为样品管的吸光度；V为样品液总体积，mL；Vt为测定时样品用量，mL；W为样品鲜重，g；蛋白质含量单位为mg/g。下载本文
