一、高产SOD酵母菌

酵母菌中SOD 含量相对较高,据Nedeva 等人报道,不同种属的酵母菌细胞中SOD 含量有所差异,粗酶液中每毫克蛋白的比活在10～40 个酶活单位之间。

1994 年北微所张博润等人经单倍体分离、诱变和群体杂交等手段选育到1 株SOD高产酵母菌ZDF248,SOD 产量为1350 U/g湿菌体[7] ,对其进行培养条件优化后,产量提高至2075U/g湿菌体[8]。

1997 年王岁楼等人自然筛选出1株SOD高产菌株Y-216,酶活可达600U/g 湿菌体[9]。

吴思方等人研究了从啤酒废酵母生产、提取、纯化SOD的方法和条件,得到比活为3048U/mg的SOD酶,指出开展啤酒废酵母生产SOD的综合利用具有经济价值和社会意义[10]。

2000 年王岁楼等人从活性干酵母中提取SOD,其产量可达1079U/g,在优化培养条件下,SOD产量可达1948U/g菌体,发酵液产酶能力为7.7万U/L发酵液[11]。

二、细胞破壁

酵母SOD为胞内酶,冯清平对5种产SOD酵母的破壁方法进行了研究,分别以超声波、细胞自溶法、酶裂解法氯仿2乙醇法和甲苯法5种方法进行破壁,制备SOD粗酶液,结果表明甲苯法效果最优,酶活力分别为前4种方法的6.25,2.01,1.08和1.29倍[4]。

上述资料来源于：

[ 7 ] 张博润,田宇清,黄英,等.酵母超氧化物歧化酶高产菌的选育[J].微生物学报,1994 ,34 (4):279～284.

[ 8 ] 　张博润,黄英,田宇清,等. 酵母SOD 高产工程菌培养优化条件研究[J ] . 微生物学通报,1994 ,21 (4) :210～213.

[9 ] 　王岁楼,张平之,张欣,等. 酵母SOD 形成的生理学研究[J ] .工业微生物,1997 ,27 (3) :21～23.

[10 ]吴思芳,方尚玲,童振球,等.啤酒废酵母提取SOD 研究[J].食品科学,2000,21 (3):22～25.

[ 11 ] 王岁楼,张鑫,张平之,等. 活性干酵母SOD 摇瓶发酵条件的

研究[J ].工业微生物,2000 ,30(3):36～39.

    三、菌体细胞中线粒体的存在对整个细胞中超氧化物歧化酶活力的大小有着重要影响

    徐建祥[4]实验表明:酿酒酵母ND260 菌体细胞中线粒体的存在对整个细胞中超氧化物歧化酶活力的大小有着重要影响,线粒体的存在有助于提高细胞中超氧化物歧化酶的活力,而线粒体本身也较高的超氧化物歧化酶比活力。

     四、培养基的配比、培养温度、时间、通气量、PH对SOD含量的影响

    王梦楼等[3]对酵母菌Y-216及冯清平等[5]对卡尔酵母BY2 的研究表明,碳源、氮源、碳氮比和金属离子等营养条件及培养温度、时间和通气量等培养条件,均对酵母菌的SOD含量有较大的影响。以麦芽糖为碳源时菌体SOD含量最高,而以蔗糖为碳源时菌体发酵液中SOD总活性最高;氮源对SOD形成影响较大,其中有机氮优于无机氮,尤以蛋白胨为氮源时菌体SOD含量最高;碳氮比为1∶1为宜;微量的Cu2+、Mn2+、Fe[3+]均能促进SOD的形成,但Cu2+、Mn2+明显抑制菌体生长;Fe3+单独作用时不仅可以促进菌体的生长,而且可以使SOD的含量提高2.1倍。最适宜培养时间取对数生长期末期,适宜的pH范围是4.5～5.0,适宜培养温度为30℃,最适接种量12.5%,提高通风量有利于SOD的形成。冯清平[5]还由试验得出对数生长后期菌体内酶含量最高,菌体生物量也基本达到顶峰,所以此时提取SOD产量也最高。徐建祥等[4]确定了摇瓶培养酿酒酵母菌株(ND260)生产SOD的最适工艺条件:采用酵母完全培养基,其中含葡萄糖5%、(NH)2SO4 0.3%、Cu2+ 3.0×10-6、Zn2+ 3.0×10-6 ,pH 值6.5;500ml三角瓶的装液量为70ml,在28℃条件下摇床培养22h。在此培养条件下,ND260菌株的细胞生物量为4.36g/100ml培养基,细胞中的SOD活力为613μ/g

菌体。

Taniguchi等[6]研究表明,在氧气压力达6atm的肉汤培养基中培养乳酸链球菌时,SOD活力比在厌氧条件下培养基中培养乳酸链球菌时,SOD活力比在厌氧条件下培养的2倍还高。而且SOD活性增加不仅发生在对数生长阶段的后期,还发生在稳定阶段的前期。因此,先在有微过滤模块的厌氧发酵罐系统中得到高密度的乳酸链球菌发酵液,然后再用高压氧加压,可提高SOD的生产力。Hansson等[7]曾进行培养酿酒酵母(Cu ,Zn2SOD 和Mn2SOD)和乳酸链球菌(Mn2SOD)的研究,发现用葡萄糖流加法培养酿酒酵母,每发酵灌体积SOD的活力要比批量培养时的高,培养基中含乙醇时SOD的活性较高,用过滤式发酵罐培养乳酸链球菌能增加细胞的密度。

[4 ] 　徐建祥,彭志英,赵谋明,等. 酵母菌ND260 菌株产SOD 特性的研究[ J] . 华南理工大学学报,1998 ,26 (2) :7.

[5 ]冯清平,张晓君.酵母菌中超氧化物歧化酶的研究[J].微生物学报,1995,354:280.

[6]Taniguchi M,Hoshino K,Itoh T,et al.Production of superoxide dismutase in Streptococcus lactis by a combination of use of hyperbaric oxygen and fermentation with cross2flowfiltration [ J] . Biotechnology and bioengineering ,1992 , 39(8) :886.

    提取工异丙醇艺

将预处理过的酵母泥加入异丙醇（异丙醇浓度为90%，酵母泥：异丙醇9：1），浸泡120min，抽滤出异丙醇。再加入3 倍体积50mmol/L磷酸钾缓冲液（PH=7.0），搅拌120min，离心除去菌体，即得SOD粗提液。用2mol/L HCL调节SOD 粗提液至PH5.0，加入丙酮（温度4℃~10℃，PH5.0）搅拌均匀为止，使丙酮：粗酶液(v/v)=0.8:1（此时杂蛋白沉淀最多），5000r/min离心，除去沉淀杂蛋白，调节上清液PH4.0（为SOD的等电点），加丙酮（控制其温度为4℃~10℃），使丙

酮:SOD 清液v/v)=0.3:1，此时SOD沉淀的酶比活最高，达3048u/mg。经丙酮2次分级沉淀纯化SPD回收率达73%，纯化倍数达96倍。

分步萃取法

萃取衫

甲：0.2mol/L柠檬酸（42g柠檬酸·H2O/L）。

乙：0.2mol/L柠檬酸三钠·2H2O（58.8g/L）。

甲:乙体积比为0.1:4.5，此混合溶液PH=6.2，再用少量NaAc 饱和溶液仔细调整PH至7.4~7.8范围内。

操作

将洗净并预处理过的酵母泥（最好再经过复壮）在充分搅拌下依次地加入原料的0.34倍上述萃取液和1倍量事先备好的6.5%NaCl溶液，剧烈搅拌30min以上，注意PH应维持在7.6以保证萃取效果，从而保证SOD回收率。

除杂蛋白得粗品SOD

充分搅拌上述萃取液，并缓缓加入事先配制好的适量CuCl2饱和溶液（ 用量比例每100ml原料加

40g CuCl2饱和溶液）。混合均匀后用水浴加热至68℃，恒温30min，急冷至室温，精细过滤，收集滤液。此时应得到澄清的滤液，不澄清应重新精细过滤。将澄清透明的滤液用少量乙酸钠(NaAc)饱和溶液精细调整其PH为4.8~5.2。置于事先准备好的冰盐水混合浴中，使其冷却到0℃

以下，然后在充分搅拌下加入1~2倍丙酮(0℃~4℃)即析出大量沉淀。低温下静置，抽滤得沉淀

物后，将其复溶于适量纯水中，仔细过滤除去不溶物得清液。在清液中再加入0.75~1倍体积的冷丙酮，经0℃静置，抽滤得沉淀，真空冷冻干燥即得到呈淡蓝绿色粉末的SOD粗品，比活值可达#"""8A0: 以上。

3000u/mg以上。

精品SOD

粗品SOD溶于PH6.5,2.5mol/LK2HPO4-KH2PO4缓冲溶液中， 经超滤得澄清液， 将清液上DEAE-Sephadex A-50层析柱（ф7.5cmx40cm），该柱事先用上述缓冲液平衡， 流速应控制在100ml/h~200ml/h。上样至饱和后，用同一缓冲液进行梯度洗脱，流速为100ml/h~120ml/h。仔细地通过取样监测SOD 活性的蛋白峰，紫外光吸收的光密度最大值Cu˔Zn- SOD为258nm, 可见光为680nm。

将上述过程中收集的SOD洗脱液装入透析袋中，在蒸馏水中析出盐后，将透析液超滤浓缩，减压冷冻干燥即得到外观带淡蓝绿色的，酶比活达到10000u/mg，分子量（相对分子量）3.2X104，亚基分子1.6X104的精品SOD。

本法较之离心萃取法虽手续繁琐，但不用离心机，收率高，产品质量稳定，经济效益显著。

微滤超滤法提取SOD

本法是有待开发的创新技术，膜分离技术是本世纪高科技边缘学科， 分离过程中不存在化学反应，可避免物料受热破坏，高效低耗是膜技术的独特优点。SOD 是生物大分子的活性物质，分子量（绝对分子量）约5.3123x10-23kg，利用微滤超滤法提取SOD，工艺上具有无相变、低温、活性损失小、回收率高、操作简单等特点。

将处理过的复壮后的酵母泥在PH偏碱性的条件下，经均质机打成匀浆，加水浸提，将提取液经10um、0.1um 膜2次微滤后， 去除微小杂质。然后先用1.32808x10-22kg 分子量的超滤膜截留大分子物质，收取透过液，再用1.606x10-23kg分子量的超滤膜截留SOD。

用甲苯破壁法从耐高温酒精活性干酵母( TH-AADY) 中直接提取SOD

主要试剂: 邻苯三酚( 焦性没食子酸) 、三羟甲基氨基甲烷( Tris) 、盐酸、甲苯等, 均为国产分析纯; 聚乙二醇6000, 系日本进口分装.

甲苯法

( 按10 g AADY 加入16 mL甲苯在35℃ 下破壁45min, 再加入pH7.8、浓度0.05 mol/L 的磷酸盐缓冲液30 mL 和0.5 mL 的EDTA 溶液, 于室温下提取5 h, 最后以3000 r/ min 离心20 min, 收集上清液即为粗酶液).

胚芽是玉米粒中唯一的活性部位，大约占12%左右(干重)。胚芽含有玉米主要的遗传信息:酶、维他命和矿物质，使得籽粒长成玉米庄稼。胚芽中大约25%是玉米油，它是玉米中最有价值的成分。玉米油分离后，剩余的成分用于动物饲料。

玉米SOD提取的工艺流程

100g米→浸泡→粉碎→打浆→浸提→离心(5OCOr/min，15min)→一次盐析→离心(5000转，15min)→二次盐析→离心(5000转，15min)→沉淀溶解→超滤(截留相对分子质量10000)→冷冻干燥

玉米胚芽SOD的纯化

玉米胚芽SOD粗酶液进行盐析，离心，取沉淀用少量0.05m/L,pH.78磷酸缓冲液溶解。通过预先经过pH7.8的0.025mol/L磷酸盐缓冲液平衡的DE一52纤维素层析柱(2.0cmX80cm)，.用0.025mo呱~0.2mol凡的pH7.8磷

酸盐缓冲液进行梯度洗脱，流速lmUmin，每管收集ZmL。透析后再通过

sPelidaexG一75层析柱174】(l.5nclx60ncl)，用.005m。呱pH.78磷酸缓冲液洗

脱，流速为lmUmni，ZmL收集1管。测酶活后合并，透析后冷冻干燥，即

得到玉米胚芽SOD冻干粉。下载本文