作者简介：王一平（1984－），女，硕士研究生，主要从事疫苗质控和研究评价工作。
通信作者：梁争论，博士，研究员，主要从事肝炎病毒、肠道病毒方面的研究工作。E-mail：lzlun good·163．com ·综述·
柯萨奇病毒A组16型研究进展
王一平综述；毛群颖，梁争论审校
（卫生部生物技术质量控制重点实验室，中国食品药品检定研究院，北京100050）
摘要：柯萨奇病毒A组16型（CA16）是引起手足口病（HFMD）的主要病原体，与肠道病毒71型（EV71）交替或共同流行；特别是近年在西太平洋地区呈现流行强度高、重症和死亡人数多的特点，已成为该地区的重大公共卫生问题。研发安全有效的疫苗是控制HFMD流行的有效手段。由于EV71所致疾病在重症和死亡病例中所占比例高，对其疫苗研发得到了广泛关注，全病毒灭活疫苗已进入III期临床，有望即将应用于婴幼儿HFMD的防控。EV71疫苗的顺利研发随之也增加了对CA16疫苗研发的迫切性。近年来日本、新加坡以及中国地区逐渐开始关注CA16相关的研究，我国也有多家企业开展CA16疫苗的研发。本文就CA16的病原学，流行病学，实验室诊断，治疗和预防等方面进行了综述。
关键词：柯萨奇病毒A组16型（CA16）；疫苗
中图分类号：R373．2+3文献标志码：A文章编号：1005-5673（2012）03-0062-05
Progress in research on Coxsackievirus A16
WANG Yi-ping，MAO Qun-ying，LIANG Zheng-lun
（Key Laboratory of the Ministry of Health for Research on Quality and Standardization of Biotech Products，
National Institute for Food and Drug Control，Beijing，100050，China）
Abstract：Coxsackievirus A16（CA16）is one of major pathogens associated with human hand，foot，and mouth diseases （HFMD）．It always circulates alternatively or combanatively with Enterovirus71（EV71）on a global scale and caused many HFMD outbreaks．In particular，in recent years the epidemics of HFMD have appeared high strength，more severe cases and deaths in the Western Pacific region，the diseases have become a major public health problem in this region．The effective way to control the HFMD epidemic is to generate a safe and effective vaccine．Due to high proportion of severe ca-ses and deaths，the development of EV71vaccines have obtained a widespread concern and its inactivated whole-virus vac-cines have entered Phase III clinical trials，which are expected to be used in the prevention and control of HFMD in infants and young children in the near future．The smooth development of the EV71vaccine brings about the urgency of the re-search and development of CA16vaccine．Recently，more and more attention has been paid to CA16-related research in Ja-pan，Singapore and Taiwan area，China，and several Chinese enterprises have carried out the development of CA16vac-cine．In this paper，etiology，epidemiology，laboratory diagnosis，treatment and prevention of CA16are reviewed．
Key words：Coxsackievirus A16（CA16）；Vaccine
1CA16病原学
柯萨奇病毒（Coxsackievirus，CV）属于小RNA 病毒科肠道病毒属，可引起心肌炎、脑炎、肾炎、结膜炎等多种疾病。1948年，Dolldorf和Sickles在纽约市柯萨奇镇的一次脊髓灰质炎病毒（Poliovirus，PV）流行中，通过乳鼠分离的方法首次成功分离出具有不同血清型的多种柯萨奇病毒，并依据病毒对乳鼠的致病性将它们分为A、B两组。迄今为止，已有30个血清型（A1-24，B1-6）。柯萨奇病毒A组16型（Coxsackievirus A16，CA16）是CV的主要成员之一，1951年首次在南非被成功分离［1］。CA16为20面立体对称球形颗粒，直径为23 30nm，无包膜和突起，由核酸和蛋白质组成。其核酸是单股正链RNA，全长约为7410个核苷酸，基因组含一个开放读码框架（ORF），编码一个多聚前体蛋白，经蛋白酶切水解为P1、P2和P3三个前体蛋白，P1编码病毒的结构蛋白VP1、VP2、VP3和VP4，组成病毒衣壳，VP1区长1bp，编码297个氨基酸残基，是病毒主要的中和抗原决定簇所在的部位；P2、P3区编码非结构蛋白。RNA两侧为5'-和3'-非编码区（UTRs），分别含有多肽翻译和RNA合成的起始信号，在3'-非编码区的末端带有一个长度可变的多聚腺苷酸尾巴（poly-A）。5'-非编码区结构保守，所以常被用作设计PCR引物的区域［2］。
2CA16的致病性
CA16是引起手足口病的主要病原体，主要引起5岁以下婴幼儿出现手、足、口部疱疹、咽峡炎等症状，少数患者可出现心肌炎、无菌性脑膜炎等多种并发症。轻症患者临床症状与EV71引起的HFMD难以区别，需借助实验室诊断方可明确病原体。急性咽峡炎是CA16的另外一个主要临床症状，在中国地区、日本和中国地区的EV71流行中都曾有报道。其中1998年中国EV71和CA16流行期间急性咽峡炎患者比例较大约10%（6/ ）［3］。以往研究多认为CA16只引起轻症患者，但近年来，越来越多报道显示除引起轻症外，CA16感染亦可导致心肌、心包、脑部和肺部等疾病，甚至引发致死性心肌炎、脑干脑炎和肺炎等致死性症状。重症及死亡病例在美国［4］、日本［5］、中国［6］、中国［7］及法国［8］均有报道。文献［9－10］报道CA16感染还与多起自发性流产相关。
3CA16的流行病学特征
CA16可通过粪-口途径以及密切接触方式迅速传播，易在学龄前儿童中引起暴发和流行。自1957年首例HFMD在多伦多报道以来［11］，常与EV71交替或共同流行，已造成全球范围内多次大流行［12-16］。目前研究显示，包括柯萨奇A、柯萨奇B 和埃可病毒等20多种肠道病毒均可引起HFMD，但其中CA16和EV71是导致HFMD的主要病原体。EV71多与重症患者相关而受到关注。但CA16分布范围广，发病人数多，常常占HFMD发病的60%以上。1994年英国最大一次HFMD流行是由CA16引起的，感染人群主要为1 4岁的婴幼儿［17］。1999－2006年中国地区的HFMD中CA16引起的病例数占首位（2579例），其次为EV71（1760例）［18］。在新加坡2001－2007年间发生的HFMD 中，有3年（2002，2005和2007年）主要流行株为CA16，1年（2006年）为EV71［19］。2001－2009年的HFMD中，以CA16为主的CA流行约占HFMD 流行总量的80%，是引发HFMD的主要病原体，EV71是引起HFMD流行的第二位病原体［20］。在中国深圳1999－2004年间HFMD流行中，147个样本中CA16阳性样本数为41例，EV71阳性样本数19例［21］。由于CA16多以轻症患者为主，往往不需特殊医疗干预就可自行痊愈，因此实际流行数字应较以上调查结果更高。
3．1CA16分子流行病学
目前尚无公认的CA16基因分型依据，Li等［21］利用CA16的VP4核苷酸序列差异将CA16分为A、B、C3个分支，并认为亚洲在20世纪90年代前以A 和B2个分支的流行为主，其中B分支为主要流行株；90年代后CA16的基因发生了变化，形成了C 分支，并逐步取代了B分支而成为主要流行株。有学者利用VP1的基因全序列将CA16分为A、B、C3个基因型，其中又将C基因型分为C1、C2、C33个亚型，并认为在1995－1998年间，CA16由B型向C 型转变，在2002年左右，从C1亚型向C2亚型转变，并在2005－2007年转变为C3亚型［13］。还有学者使用VP1和VP4对CA16进行了基因的进化分析，发现VP1和VP4的分型结果基本相同，均可将病毒分为A型和B型，其中B型又分为2个分支。并认为CA16的流行型别与流行时间的关系更为密切，与流行区域关系不大［22］。由于低保真复制和频繁的重组，CA16具有高突变率的特点［23］。有研究提出近来在中国流行的CA16病毒为复合的重组病毒，包含多种A型肠道病毒，如CA4，CA16和EV71［24］。加强CA16病毒全基因组的研究，对其流行病学研究具有重要意义。
3．2CA16血清流行病学
CA16虽有多个基因型，但仅有一个血清型。在2008年以前CA16的血清流行病学几乎属于空白阶段。近两年，随着对CA16研究的逐渐重视，中国［25-26］、德国［27］等国家逐渐开展了相关研究。结果显示无论在HFMD高流行的中国还是低流行的德国，在健康人群中普遍存在CA16中和抗体。在儿童中，CA16抗体阳性率和效价均随年龄增长逐渐升高，在中国抗体升高年龄更早，5岁以内抗体阳转率与德国5 9岁相近（43．4%与52．0%），成人抗体阳性率持续高水平，抗体滴度逐渐降低。在儿童中，人群抗体水平受地域和气候影响较大，如中国中东部地区的安徽、河南阳性率最高分别为62．6%和61．1%，而最北部地区的黑龙江仅为8．0%，具有明显的地域差异［26-27］。多重感染是肠道病毒的常见现象，通过对2004年中国开封农村［28］和2006年德国法兰克福［27］儿童的CA16和EV71血清流行病学调查显示，两地区均有部分人群存在CA16和EV71双抗体阳性，且双阳性率均随年龄增长显著升高，开封地区25 30月龄组人群双阳性率（33．3%）与法兰克福5 14岁组接近（约30%），提示EV71和CA16肠道病毒主要成员在各地均有较广泛的流行。
经实验室对133对母婴（0、2、7月）配对血清进行中和抗体研究［25］，结果显示92．5%的新生婴儿携带CA16母传抗体，出生后抗体迅速衰减，至2、7月龄时仅有38．3%和0．75%的婴儿体内尚可检测出母传抗体。但有5个婴儿（12．8%）已较2月龄中和抗体出现4倍及以上升高，提示在7月龄婴儿中已有少部分（3．76%）婴儿出现CA16感染，与临床患儿多在0．5岁以上现象一致。
4实验室诊断
已知的人肠道病毒成员包括多种血清型，它们在遗传上紧密相关，这给CA16的鉴定带来一定困难。一是因为CA16引起的手足口病与其他柯萨奇A组病毒、B组病毒和EV71病毒引起的手足口病在临床上难以区分；二是因为CA16往往与EV71伴随流行。
4．1病毒分离
肠道病毒分离可用咽拭子、直肠拭子、疱疹液、粪便、体液及组织液等标本，经青霉素（1000IU/ mL）和链霉素（1000μg/mL）处理后，接种单层Vero 细胞或RD细胞，培养1 3代，待出现典型的细胞病变后，将细胞收集再分离病毒。当发现有中枢神经系统症状时，可从脑脊液进行病毒分离。分离标本在－80ħ可长期保存。该方法是病原学检测的经典方法，但存在费时费力，对样品要求较高，检出率低的问题。
4．2病毒抗体检测
血清学检测也是肠道病毒诊断的常规方法，主要包括中和抗体检测和ELISA法。可产生中和抗体是肠道病毒的重要特征之一，中和抗体的存在可特异性的阻断、中和病毒，在疾病预防和诊断中具有重要作用，恢复期患者中和抗体4倍及以上升高常被用作临床诊断的标准之一。传统中和试验一直是CA16实验室诊断的“金标准”，包括蚀斑减少法和细胞病变法，两者均须应用细胞培养技术，操作步骤繁琐，实验室控制要求高。目前，由于该方面研究较少，各实验室多采用1951年分离的标准毒株（G-10，A基因型）进行中和抗体检测，与目前各地流行的毒株已存在较大遗传差异，G-10与现有流行株抗原特性是否一致，是否适用于现代CA16中和抗体水平的检测和评价等问题均亟待研究解决。由于传统中和试验存在检测周期长，检测结果需根据经验进行主观判定的缺点，应开展快速、客观、准确的新方法的研究和建立。假病毒中和试验是近年来出现的EV71中和抗体检测方法，具有耗时短、高通量、客观、灵敏度高等优势。目前已有部分试验室开展应用该方法检测CA16的相关研究。
ELISA法是一种用于检测病原微生物的常规方法，包括IgG和IgM检测。IgM是早期诊断的重要指标，IgG往往用于血清流行病学调查和恢复期血清抗体的检测，它们都具有操作简单、快速、灵敏、经济的优点，但由于人肠道病毒的成员多，存在共同抗原位点，交叉反应是肠道病毒ELISA检测中常常关注的问题，如何在保证灵敏度的基础上降低交叉反应保证试剂盒特异性应予以重点研究，并考察IgG 与中和抗体检测的相关性，以达到最终替代中和抗体检测的目的。
4．3分子生物学检测
RT-PCR是近年来实验室常用的检测手段，克服了病毒分离及传统中和试验费时费力，无法满足大量样本同时处理的问题，已成为CA16快速诊断的重要手段。与其他肠道病毒检测方法一样，基于VP1和VP4序列的CA16的分子检测技术已日益成熟。Tan等基于CA16的VP1区设计出引物，使用RT-PCR进行检测，在67例临床结果疑似HFMD而病毒分离均为阴性的原始样本中，发现48例EV71阳性样本，11例CA16阳性样本，1例CA16和EV71双阳性，7例全阴性样本［29］。另一种微生物感染诊断新技术是基因芯片技术（Microchip Ar-ray）。Chen等［30］结合芯片技术和RT-PCR建立了灵敏准确诊断CA16和EV71的方法，结果表明该方法对CA16的灵敏度为95．8%，检测每个样本所花费的时间仅为6h。该法最大优势是检测速度快，特别适合用于大样本检测。
5治疗与预防
5．1CA16的治疗
文献［7，31］报道有5．10% 8．65%的CA16患者可出现重症并发症。由于缺乏特异、高效的抗病毒药物，目前，对于重症CA16患者的治疗主要以对症治疗为主。1981年，Herrmann等曾尝试用Guani-dine治疗CA16感染的乳鼠，有一定的疗效［32］，但未见应用于人体的报道。另外，静脉注射丙种球蛋白（IVIG）能有效地抑制炎症的发生，对CA16引起的感染有一定的疗效，曾在1998年中国和2000年澳大利亚的HFMD流行中得到应用。
5．2CA16的预防
近几年的流行病学资料显示，中国已成为HFMD高流行区，每年HFMD报告病例数均在100万以上，流行人数多、流行时间长、发病年龄小，给学校、幼儿园、医疗机构以及整个社会均带来极大压力。CA16虽然多引起轻症HFMD，但常与EV71混合或交替流行，不但增加了RNA病毒基因重组概率，而且增加了混合感染的可能性，加大了HFMD 流行和防控的复杂性［24］。有研究显示，CA16和EV71混合感染易导致中枢神经系统并发症（CNS），且病情更重、病程较长，危重型发生率较高［33］。中国2008－2010年在湖南、2009年在杭州、2010年在北京、2010年在佛山地区CA16和EV71的混合感染率分别为0．62%、14．3%、7．4%和9．3%［34］。因此仅研发EV71单价疫苗无法达到控制HFMD流行的目的。为建立完善的HFMD防控体系，特别是需要应对EV71疫苗上市后HFMD仍将持续流行的态势，急需开展CA16单价疫苗或与EV71联合的双价疫苗的研究。
作为肠道病毒疫苗一员的脊髓灰质炎疫苗，已经在全球脊髓灰质炎防控实践中取得了巨大的成功，我国全病毒灭活EV71疫苗的研发目前也取得了较大进展，在临床I、II期试验中初步证明了疫苗在人体的安全性和免疫原性。同类肠道病毒毒株筛选、工艺、质控和评价的经验将有助于CA16疫苗的研发。
目前研究显示，CA16感染和动物免疫可在恢复期和免后数周产生高滴度中和抗体［35］，中和抗体可在细胞基质上中和病毒，阻断病毒引起的特异性细胞病变。流行病学资料显示，中和抗体水平与地区流行情况和年龄密切相关，安徽、河南等高流行区抗体水平在1岁前即明显高于低流行的黑龙江，1岁后阳性率逐步升高，与HFMD发病率呈负相关［26］，以上研究均提示CA16中和抗体具有特异性保护作用，为疫苗研发奠定了理论基础。
6细胞模型和动物模型
目前研究显示，CA16可在Vero、RD（rhadomyo-sarcoma，胚胎横纹肌瘤）以及二倍体细胞上体外培养、扩增，为病毒分离、检测以及疫苗研发提供了条件。理想的动物模型是研究CA16致病机理、评价疫苗保护效果和药物治疗效果的重要工具。在EV71疫苗研发方面，乳鼠、食蟹猴和猕猴等模型的建立和不断完善，证实了疫苗诱导中和抗体的保护作用，促进了EV71疫苗顺利发展［36-38］。而CA16至今尚无动物模型成功建立和应用的报道，良好的动物模型已成为直接影响疫苗研发和评价的重要瓶颈，应尽快开发符合我国流行特征，稳定性优良，适用于疫苗免疫效果评价的动物模型。
7展望
CA16和EV71引起的HFMD已成为我国的一种严重的公共卫生问题。研发疫苗为控制该病流行的唯一有效手段。但相对于EV71，对CA16的相关研究投入较小，CA16疫苗研发的基础弱，对CA16所致HFMD的感染、致病机制、临床特点及转归了解较少，缺乏流行病学研究资料，也无可用于评价的动物模型以及规范的检测试剂，因此CA16疫苗研发较EV71疫苗研发难度可能更大。急需借鉴EV71疫苗研发的经验，形成基础研究、流行病学调查、疫苗研发、质量管理和质量控制、临床试验和应用等多单位密切协作的机制，科学、规范、有序地开展我国CA16疫苗的研发。
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