一、确定污染类型

1、PCR实验室发生污染后主要表现为：1）所有同批次标本及阴阳对照全部为阳性；

2）阴阳对照正常，所有标本检测均为阳性；

3）除了CT值靠前的标本其余标本及阴性对照CT值接近临界值，都有微弱翘尾。

出现以上三种情况，均可判为发生污染。PCR污染类型分为样本污染和产物污染。

所谓样本污染一般发生在操作2区，由使用被污染的耗材和样本交叉污染产生；产物污染有PCR扩增产物引起，一般发生在扩增分析区，即3区，由于PCR反应体系没有完全闭合或者扩增后的体系没有及时安全清理引起。

2、确认污染类型才能有效清除污染。发生污染后，更换所有一次性耗材即移液及使用新拆分试剂。有两种简易方法如下：

1）不加内标重复实验，检测结果如果内标没有扩增，可判为样本污染，反之为产物污染。

2）分A和B两组，A组在上机前，八联管开盖在2区放置10min左右，B组闭合八联管直接上机。检测结果中若A组发生污染B组正常，则为气溶胶污染。气溶胶污染有两个来源，其一为扩增产物引起，其二为浓度较高的标本在制备过程中外释累积形成。

二、污染处理措施

一般而言，发生产物形成的气溶胶污染是很难在短时间内及时清理掉的，这是由PCR反应的特点决定的，及其微小的污染物都可以作为模板扩增，释放出巨大荧光信号。因此，很多试剂厂商都有相应的防污染试剂产品，可以有效防止产物污染，其原理为UNG酶对产物核酸片段的有效降解，而不影响我们从标本制备来的核酸模板。但是，彻底消除污染，降低对UNG酶的依赖，还需要一套消除污染的体系来应对。具体如下：

1、全面规范操作：

1）进行PCR操作时，工作人员应该严格遵守SOP操作规程。

2）试剂准备、标本制备区、PCR扩增区及分析区设计要合理，要有一定的方向性。工作人员要谨循由试剂准备→标本制备→PCR扩增区及分析区的工作流程。

3）任何一间的产物及器材不要拿到其它两个工作区。特别要提醒的是各区要有的打扫工具，切记不可窜用。如有专门的打扫人员，因对其进行相关知识的培训。

4）使用一次性吸头，吸头不要长时间曝露于空气中，避免气溶胶污染。

5）操作多份样品时，制备反应混合液，先将dNTP、缓冲液、引物和酶混合好，然后分装，这样既可以减少操作，避免污染，又可以增加反应的精确度。PCR试剂，PCR反应液应与样品及PCR产物分开保存，不应放于同一冰盒或同一冰箱。

6）最后加入反应模板，加入后盖紧反应管。

7）要轻拿轻放，开盖要轻，尽量避免气溶胶污的产生。

8）每次实验完后，扩增产物都要及时密封后处理。

9）每次做完实验，要养成对生物安全柜和超净工作台进行消毒的好习惯。

2、PCR实验室污染全面清理

污染发生后，需要对实验室各个部位、大型器材及角落进行彻底清理。具体如下：

1）通风处理：

以上是最高标准的PCR实验室，其风向设置能有效避免不同区域空气流动，防止整个PCR实验室污染。但是一旦发生气溶胶污染，也不可避免的使得各个区都产生气溶胶污染，这也是由于PCR的敏感性决定的。针对气溶胶污染，最有效的是通风处理，即打开PCR实验室与外界空气的流通，从而快速使得污染区域的气溶胶被有效稀释。

2）实验室垃圾处理

使用过的废弃头、EP管等一次性耗材及时封闭处理掉，不能较长时间滞留废液桶和垃圾桶。另外废液桶使用前，灌入一定量的84消毒液或者次氯酸溶液。

3）擦拭

使用浸泡过84消毒液或者次氯酸溶液的干净桌布或者毛巾对超净工作台、实验桌面、离心机、移液等进行全面擦拭，对各区地面使用浸泡过的各区专用的拖把进行全面清理。

4）紫外消毒

核酸片段在强紫外光下极易降解变质，达到无法作为模板扩增的目的。

擦拭结束后，对实验室各个区域长时间或者过夜紫外照射。

5）空气处理

除了通风和紫外处理，可以使用纯水或者制成喷雾对实验室密集喷洒，能有效将空气中的污染物带到地面，然后执行擦拭和紫外照射处理。

以上为污染发生后实验室污染清理的基本过程，需要注意的是清理过程要每天执行，直到检测显示污染彻底清除为止。下载本文