一、概念

1、生物技术：也称生物工程，是指人们以现代生命科学为基础、结合先进的工程技术手段和其他基础学科的科学原理，按照预先的设计改造生物体或加工生物原料，为人们生产出所需产品或达到某种目的的一门新兴的、综合性的学科。

2、传统生物技术与现代生物技术 

传统生物技术主要是通过微生物的初级发酵来生产商品，包括酱、醋、酒、面包、奶酪、酸奶及其他食品的传统工艺；

现代生物技术是指在20世纪中叶后随着一些生物学领域的重要发现，以及随后产生的新手段和新技术，从而形成以现代生物科学研究成果为基础，以基因工程为核心的新兴学科。现代生物技术的产生和发展是以1953年DNA双螺旋结构模型建立为基础，以70年代DNA重组技术的建立为标志。

二、生物技术的重要性

    1）首先生物技术是解决全球性经济问题的关键技术，在迎接人口、资源、能源、食物和环境等五大危机的关键技术，可以解决人类所面临的诸如食品短缺问题、健康问题、环境问题、及资源问题；

    2）其次，生物技术广泛应用于医药卫生、农林牧渔、轻工、食品、化工和能源等领域，促进传统产业的技术改造和新兴产业的形成，对人类生活产生重大而深远的影响。

3）此外生物技术还与与伦理、道德、法律等社会问题都有着密切的关系，对国计民生产生重大的影响。

4）综述：生物技术是现实生产力，也是具有巨大经济效益的潜在生产力。将是21世纪高技术的核心内容，生物技术产业是21世纪的支柱产业。

三、生物技术的特征

生物技术与其他高新技术一样所具有的“六高”的基本特征：即高效益，可带来高额利润；高智力，具有创造性和突破性；高投入，前期研究及开发需要大量的资金投入；高竞争，时效性的竞争非常激烈；高风险；高势能，对国家的政治、经济、文化和社会发展有很大的影响，具有很强的渗透性和扩散性，有着很高的态势和潜在的能量。

四、生物技术的种类

1、时间上划分：可分为传统生物技术和现代生物技术

2、根据生物技术操作对象及操作技术的不同，可分为基因工程、细胞工程、酶工程、发酵工程、蛋白质工程、生化工程等。

五、生物技术对经济社会发展的影响

1、改善农业生产、解决食品短缺

1）提高农作物的产量及品质

•培育抗逆的作物优良品系

•植物种苗的工厂化生产

•提高粮食品质

•生物固氮，减少化肥使用量 

2) 发展畜牧业生产

•动物的大量快速无性繁殖

•培养动物的优良品系

2、提高生命质量，延长人类寿命

1）开发制造奇特而贵重的新型药品

2）疾病的预防和诊断

3）基因治疗

4）人类基因组计（HGP）

3、解决能源危机、治理环境污染

1）解决能源危机

2）环境保护

4、制造工业原料、生产贵重金属

1）制造工业原料

2）生产贵重金属

第二章 基因工程

一、概念

1、基因工程的定义：按照人为的愿望，进行严密的设计，通过体外DNA重组和转移等技术，有目的地改造生物种性，使现有物种在较短的时间内趋于完善，从而创造出新的生物类型。 

2、基因克隆载体：外源基因必须先同某种传递者结合后才能进入细菌和动植物受体细胞，把这种能承载外源DNA片断（基因）带入受体细胞的传递者称之为基因克隆载体。

3、目的基因和结构基因

目的基因的：基因工程的主要目的是通过优良性状相关基因的重组，获得具有高度应用价值的新物质（品系），为此必须从现有生物群体中，根据需要分离出可用于克隆的相关基因，这样的基因通常称之为目的基因，目的基因主要是结构基因。

结构基因：作为一个能转录和翻译的结构基因必须包括转录启动子、基因编码区和转录终止子三部分。

4、受体细胞和感受态细胞

受体细胞：从实验技术上讲是能摄取外源DNA（基因）并能使其稳定维持的细胞；从实验目的上讲是有应用价值和理论研究价值的细胞；

感受态细胞：是指处于易于摄取外源DNA片段生理状态的细胞。

5、转化和转导

转化：携带基因的外源DNA分子通过与膜结合进入受体细胞，并在其中稳定维持和表达的过程；

转导：通过噬菌体（病毒）颗粒感染，从而把外源的DNA分子导入被感染的受体细胞的方法。

二、基因工程的理论基础

1）DNA是遗传物质：核酸的组成和分类（DNA和RNA）

2）DNA双螺旋结构:1953年James D. Watson和Francis H. C. Crick揭示了DNA分子的双螺旋结构和半保留复制机制。

3）中心法则和遗传密码:1957年Crick又提出了遗传信息传递的“中心法则”,19年Marshall Nirenberg和Gobind Khorana等终于破译了个遗传密码；

三、基因工程的特征

1、跨物种性：外源基因到另一种不同的生物细胞内进行繁殖；

2、无性扩增：外源DNA在寄主细胞内可大量扩增，和高水平表达；

四、基因工程的主要操作内容

1、目的基因的获取：从复杂的生物基因组中，经过酶切消化或PCR扩增等步骤，分离出带有目的基因的DNA片断；

2、重组体的制备：将目的基因的DNA片断插入到能自我复制并带有选择性标记（抗菌素抗性）的载体分子上。

3、重组体的转化：将重组体（载体）转入适当的受体细胞中。

4、克隆鉴定：挑选转化成功的细胞克隆（含有目的基因）。

5、目的基因表达：使导入寄主细胞的目的基因表达出我们所需要的基因产物。

五、基因工程的安全性

1、对环境的影响：重新组合一种在自然见尚未发现的的生物性状有可能给现有的生态环境带来不良影响。 

2、新型病毒的出现：制造带有抗生素抗性基因或有产生病毒能力的基因的新型微生物有可能在人类或其它生物体内传播。   

3、癌症扩散：将肿瘤病毒或其它动物病毒的DNA引入细菌有可能扩大癌症的发生范围。

4、人造生物扩散：新组成的重组DNA生物体的意外扩散可能会出现不同程度的潜在危险。

六、基因工程的应用

1、基因工程在植物上的应用

1）提高植物的光合作用效率

A.提高CO2的固定率：改变与光合作用有关的酶的结构和组成（如二磷酸核酮糖羧化酶）。B.提高光能吸收率和转化率：改变光能交换系统的分子的基因结构。

2）提高豆科植物的固氮效率：使非固氮植物转变为固氮植物或能与根瘤菌共生固氮。

3）转基因植物：是农业生物技术的主要内容，是将克隆到的特殊基因导入受体植物，使之增加一些优质性状（高产、稳定、优质、抗虫、抗病等）。

2、基因工程在医药上的应用

1) 用转基因植物或动物生产药物

2) 用微生物生产药物

大肠杆菌或酵母菌生产激素（如胰岛素）、干扰素等 

3) 技术设计高效高特异性的生物制剂

应用定点突变技术设计蛋白质或酶的结构，制造出高效高特异性的生物制剂

4) 研制疫苗：制造新型疫苗（如HIV、乙肝、丙肝、霍乱、痢疾、SARS）

5) 基因治疗

6）法医鉴定

7）基因治疗（仍在探索阶段）：将正常的外源基因导入靶细胞中以弥补靶细胞所缺失或突变的基因或抑制异常基因的表达。例如基因病、肿瘤、心血管病、糖尿病等。

3、基因工程在环境保护中的应用

1) 检测水污染:用重组细菌或转基因鱼等检测水污染;

2) 生物降解:用带有重组质粒的“超级菌”分解油（烷烃类）、有机农药污染。

4. 转基因动物

将外源基因导入动物细胞，并在基因组内稳定整合，遗传给后代。

使动物成为生物反应器生产有用的活性蛋白等。

七、基因工程操作的主要技术原理

电泳技术、分子杂交技术、PCR技术、DNA测序技术、RNAi技术

八、基因工程工具酶的种类及作用

性内切酶、DNA连接酶、DNA聚合酶、核酸酶、核酸修饰酶

九、基因克隆载体

1、定义：外源基因必须先同某种传递者结合后才能进入细菌和动植物受体细胞，把这种能承载外源DNA片断（基因）带入受体细胞的传递者称之为基因克隆载体。

2、基因克隆载体的功能:运送外源基因高效转入受体细胞；为外源基因提供复制能力或整合能力；为外源基因的扩增或表达提供必要的条件

3、作为基因克隆载体应当具备的条件：必须含有复制单元，以使得目的片断能再宿主细胞内复制；必须含有标记基因；标记基因的内部必须有合适的切割位点，使得外源基因插入到标记基因内使标记基因失活，从而能鉴定出重组的DNA分子；对于表达载体来说，载体应该包括合适的控制单元，如启动子、终止子和核糖体结合位点。

4、基因克隆载体的种类:质粒克隆载体、噬菌体和病毒克隆载体、（噬菌体和质粒）复合型克隆载体、酵母人工染色体、细菌人工染色体载体、哺乳类人工染色体

十、目的基因的获得（基因克隆）

1、目的基因和结构基因的定义

2、结构基因的组成

3、原核生物和真核生物结构基因的组成（了解）

4、目的基因的分离方法(了解)

十一、基因的体外重组与转化、重组体的选择与鉴定

1、基本概念：受体细胞、转化和转导等

2、植物转基因技术：植物转基因技术是将人工分离或修饰过的功能基因导人植物的基因组中，从而引起植物体性状的可遗传改变。

1) 植物的再生（基因转化的受体系统建立）：所谓植物基因转化受体系统是指用于转化的外植体通过组织培养途径或其他非组织培养途径，能高效、稳定再生无性系，并能接受外源DNA整合对转化选择抗生素敏感的再生系统。

2）植物基因转化受体系统的条件

①高效稳定的再生能力

②较高的遗传稳定性

③具有稳定的外植体来源 

④对选择性抗生素敏感

⑤对农杆菌侵染有敏感性

3）植物基因转化系统：Ti质粒载体介导的转化系统

4）转化方法：叶盘转化法 

3、植物基因工程应用

1）抗植物虫害基因及其应用 

2）抗植物真菌病害基因及其应用 

3）抗非生物胁迫基因及应用 

4）提高作物产量改良作物品质 的基因及其应用 

第三章 细胞工程

一、细胞工程的基础知识与基本技术

1、基本知识：原核细胞和真核细胞

2、基本理论：细胞全能性 

3、基本技术：无菌操作技术、细胞培养技术和细胞融合技术

二、细胞工程的重要应用

快繁

 优质植物快速培育与繁殖； 

 动物胚胎工程快速繁殖优良、濒危品种；

 利用动植物细胞培养生产活性产物、药品； 

 新型动植物品种的培育；

 供医学器官修复或者移植的组织工程；

 转基因动植物的生物工程反应器； 

 在遗传学、发育学等领域的理论研究； 

 在能源、环保等领域的应用。

三、植物细胞工程

1、概念：

细胞的全能性: 生物体的细胞具有使后代细胞形成完整个体的潜能的特性

植物组织培养：在无菌和人为控制外因（营养成分、光照、温度、湿度等）条件下，培养、研究植物组织器官，甚至进而从中分化、发育出整体植株的技术。

外植体：即能诱发产生无性增殖系的器官或组织切段。

胚状体：指的是在组织培养中分化产生的具有芽端和根端类似合子胚的构造。

愈伤组织：泛指经细胞与组织产生的可传代的末分化细胞团

分化和去分化：

2、植物组织培养的过程

1）预备阶段：

 选择合适的外植体及其消毒处理

 配置适宜的培养基①含量丰富的基本成分，如糖类、氮、磷、钾、镁等；②微量无机物，如铁、锰、硼酸等；③微量有机物，如激动素、吲哚乙酸、肌醇等。

2）诱导去分化阶段：组织培养的第一步就是让这些器官切段去分化，使细胞重新处于旺盛有丝的分生状态。

3）继代增殖阶段

4）生根成芽阶段

5）移栽成活阶段

3、植物组织培养的类型

依据培养基分  细胞的悬浮培养

细胞的固体培养 

依据外植体材料分类   器官(组织)培养

                         细胞培养

依据培养途径分类： 愈伤组织发生

                       体细胞胚胎发生                                                                 

1）愈伤组织培养：由植物各种器官的外植体增殖而形成的一种无特定结构和功能的细胞团,然后再诱导其生根、成芽，长成完整的植株的培养方法，愈伤组织的形成包括启动、和形成三个时期。

2）细胞悬浮培养

3）器官培养

4）单倍体培养

定义：单倍体是指细胞中仅含有一组染色体的个体。

单倍体植株的诱发途径：

 天然诱发途径（孤雌繁殖、孤雄繁殖、无融合生殖等）

 人工诱导（花药培养、花粉培养、未授粉子房或胚珠培养、杂交法获得单倍体植株）。

单倍体植株培养的目的：单倍体植株仅含有一组染色体，不存在基因之间的显隐性关系，通过染色体加倍，可以创造纯合的二倍体植株，作为杂交的亲本材料，获得较高的杂种优势等

4、植物组织培养的应用

1)初级及次级代谢物的生产；

2)生物转化（利用植物培养细胞为酶源使某种前体化合物生成相应产物的技术称之为生物转化。如毛地黄细胞培养物可使毛地黄毒素转化为β甲基地高辛）；

3)天然植物食用色素的生产

4)快速繁殖，人工种子

5)无病毒植物的培育

6)转基因植物的培育 

7）人工种子的研制

定义：即人为制造的种子，它是一种含有植物胚状体或芽、营养成分、激素以及其他成分的人工胶囊。

构成：由人工种皮、胚状体和人工胚乳三部分构成。

人工种子的特点：

 不受环境因素的制约，一年四季可以进行工厂化生产；

 由于胚状体是经人工无性繁育产生，有利于保持该种系的优良性状；

 与试管苗相比，成本更低，更适合机械化田间播种；

 可根据需要在人工胚乳中添加适量的营养物、激素、农药、抗生素、除草剂等，以利于胚状体的健康生长。

人工种子的制备流程：

胚状体的制备及其同步化生长：可采用低温法、抑制剂法（DNA合成抑制剂）、分离法和通气法等进行诱导和筛选；

人工胚乳的制备：人工胚乳的营养需求因种而异，但与细胞、组织培养的培养基大体相仿，同时可根据需要在培养基中添加适量的激素、抗生素、农药、除草剂等；

人工种皮的制备：主要采用包埋剂－褐藻酸钠进行包埋，经氯化钙滴定、络合作用后形成具有一定刚性的人工种皮。

人工种子的贮存与萌发：

贮存：一般要将人工种子保存在低温（4－7C），干燥（<67％相对湿度）条件下（相对成本较高）；

萌发：在自然条件下，人工种子贮存时间较短，萌发率较低；在人为控制的条件下，萌发率相对较高。

4、植物体细胞杂交

1）定义：用两个来自不同植物的体细胞融合成一个杂种细胞，且把杂种细胞培育成新的植物体的方法

2）优势（与有性杂交方法比较）：打破了不同种生物间的生殖隔离，大大扩展了可用于杂交的亲本组合范围

3）体细胞杂交过程

Ⅰ.原生质体的制备

定义：

植物细胞原生质体是指那些已去除全部细胞壁的细胞。这部分细胞仅由细胞膜包裹，呈圆形，要在高渗液中才能维持细胞的相对稳定，

原生质球（球状体）：指在酶解过程中残存少量细胞壁的原生质体。

原生质体和原生质球都是进行原生质体融合的好材料。

①取材与除菌：常用的外植体包括：种子胚、子叶、下胚轴、胚细胞、花粉母细胞、悬浮培养细胞和嫩叶。

②酶解：反应液转绿是酶解成功的一项重要指标。

③分离：除去反应液中一些残留的组织块和破碎的细胞，可通过不锈钢网或尼龙布过滤，也可以采用低速离心法或比重漂浮法直接获取原生质体。

④洗涤：用新的渗透压稳定剂或原生质体培养液离心洗涤2-4次。

⑤鉴定：如果把它放入低渗溶液中，则很容易胀破。也可以用荧光增白剂染色后置紫外显微镜下观察，残留的细胞壁呈现明显荧光。通过以上鉴定，基本上可判别是否是原生质体及其百分率。此外，尚可借助台盼蓝活细胞染色、胞质环流观察以及测定光合作用、呼吸作用等参数定量检测原生质体的活力。

Ⅱ.原生质体的融合

①化学法诱导融合：聚乙二醇（PEG）结合高钙高pH诱导融合法已成为化学法诱导细胞融合的主流。

②物理法诱导融合: 微型电极法和平行电极法

③其他方法：不对称融合方法。

④融合可能产生的结果:

 亲本双方的细胞核和细胞质能融合为一体，发育成为完全的杂合植株。

 融合细胞由一方细胞核与另一方细胞质组成，可能发育为核质异源植株

 融合细胞由双方胞质及一方核或再附加少量他方染色体或DNA构成；

 原生质体融合后两个细胞核尚末融合时就过早地被新出现的细胞壁分开。以后它们各自分生长成嵌合植株。

Ⅲ.杂合体的鉴别与筛选

①杂合细胞的显微镜鉴别：

②互补法筛选杂合细胞： 白化互补、生长互补。

③采用细胞和分子生物学的方法鉴定杂合体：

④根据融合处理后再生长出的植株的形态特征进行鉴别：

第四章  发酵工程

一、发酵工程的含义及主要内容

1、定义：发酵工程是生物技术的重要组成部分，是生物技术产业化的重要环节。它将微生物学、生物化学和化学工程学的基本原理有机结合起来，是一门利用微生物的生长和代谢活动来生产各种有用物质的工程技术，由于它以培养微生物为主，所以又称微生物工程。

2、主要内容：包括生产菌种的选育、发酵条件的优化和控制、反应器的设计及产物的分离、提取与精制等。

二、发酵工程概况

1、主要的发酵类型：

1）微生物菌体发酵

2）微生物酶发酵

3）微生物代谢产物发酵

4）微生物转化发酵

5）生物工程细胞的发酵

2、发酵技术的特点：

1）微生物的生长特点

 发酵工程所利用的微生物主要是细菌、放线菌，酵母菌和霉菌

 对周围环境的温度、压强、渗透压、酸碱度等条件有极大的适应能力； 

 有极强的消化能力； 

 有极强的繁殖能力；

 种类多、产酶的品种多，生产容易、成本低。

2）发酵技术的特点

 发酵过程以生物体的自动调节方式进行，数十个反应过程能够象单一反应一样，在发酵设备中一次完成；

 反应通常在常温常压下进行，条件温和，能耗少，设备较简单；

 原料通常以蜜糖、淀粉等碳水化合物为主，可以是农副产品、工业废水或可再生资源（植物秸秆、木屑等）；

 容易生产复杂的高分子化合物，能高度选择地在复杂化合物的特定部位进行氧化、还原、官能团引入等反应；

 发酵过程中需要防止杂菌污染、设备需要进行严格的清洗、灭菌，空气需要过滤等。

3、发酵工程的应用

发酵工程广泛应用在医药工业、食品工业、能源工业、化学工业、冶金工业、农牧业、环境保护等行业中，而且发挥越来越重要的作用。

三、微生物发酵过程

1、发酵方法的类别

                        厌氧性发酵

根据微生物的种类分类    好氧性发酵

                        兼性发酵

                    敞口发酵

根据发酵设备分类   密闭发酵

                    浅盘发酵

根据培养基的物理性状分类   固体发酵

                          液体发酵

2、工业生产常用微生物：细菌、放线菌、酵母菌、霉菌和其他微生物（担子菌、藻类 ）

3、培养基

1）培养基的种类：孢子培养基、种子培养基和发酵培养基。

孢子培养基：孢子培养基是制备孢子用的。生产中常用的孢子培养基有麸皮培养基、大（小）米培养基，由葡萄糖（或淀粉）、无机盐、蛋白胨等配制成的琼脂斜面培养基等。

种子培养基：是供孢子发芽和菌体生长繁殖用的。常用的原料有葡萄糖、糊精、蛋白胨、玉米浆、酵母粉等，培养基的成分随菌种而改变。

发酵培养基：发酵培养基是供菌体生长繁殖和合成大量代谢产物用的，要求此种培养基的组成丰富完整，营养成分浓度和粘度适中，利于菌体的生长，进而合成大量的代谢产物。

2）酵培养基的组成：碳源、氮源、无机盐和微量元素、生长因子、水和产物形成的诱导物、前体和促进剂

4、发酵的一般过程

1）上游工程

 菌种的分离、纯化与选育

 菌种斜面培养

 种子扩大培养

 发酵罐的清洗、灭菌

 培养基的配置和灭菌等

2）中游工程

 微生物发酵及控制：发酵是微生物合成大量产物的过程，是整个发酵工程的中心环节。包括分批发酵、半连续发酵和连续发酵、固体发酵和液体发酵等。影响发酵的因素很多，如温度、pH、通风、搅拌、罐压力等等，必须适当地控制影响发酵的各种条件，掌握发酵的动态，并进行杂菌的检查和产物测定，使整个发酵过程顺利进行。

3）下游工程：

 发酵产物的分离、纯化和精制：

发酵液的预处理和固液分离：目的是改善发酵液性质，以利于固液分离，常用酸化、加热和加絮凝剂等方法；

提取：目的主要是浓缩，也起到对产物一定的纯化作用，常采用吸附法、离子交换法、沉淀法、萃取法、超滤法等；

精制：进一步纯化发酵产物，可采用沉淀、超滤、层析等方法。

成品加工：对获得产物进行最后的浓缩、无菌过滤和去热原、干燥、加稳定剂等。

四、发酵操作方式及工艺控制

1、发酵的操作方式

1）分批发酵：先将空罐杀菌，培养基装入发酵罐，接种之后进行培养，在培养过程中，培养基成分减少，微生物增殖。微生物周围的环境随时间而变化，是一种非稳态操作法。

优缺点：此法不易染菌，但很难采用控制基质等浓度的方法来增大发酵生产能力。在分批发酵系统中，微生物具有典型的生长周期（延滞期、指数生长期（对数生长期）、减速期、静止期或稳定期、衰亡期）。目前多用在酒精、氨基酸、抗生素生产中。 

2）连续发酵：在往发酵罐中连续供给新鲜培养基的同时，将含有微生物和产物的培养液，从发酵罐中连续放出，叫做连续培养法。

优点：可以维持稳定的操作条件，有利于微生物的生长代谢，从而使产率和产品质量也保持相对的稳定；能够有效地实现机械化和自动化，降低劳动强度，减少操作人员与病原微生物和毒性产物接触的机会；减少设备清洗、准备和灭菌等非生产占有的时间，提高设备利用率，节省劳动力和工时；由于灭菌次数减少，使测量仪器探头的寿命得以延长；

缺点：由于是开放系统，加上发酵周期长，容易造成杂菌污染；在长周期连续发酵中，微生物容易发生变异；对设备、仪器及控制元器件的技术要求较高；

粘性丝状菌菌体容易附着在器壁上生长和在发酵液内结团，给连续发酵操作带来困难。

3）补料分批发酵：又称半连续发酵，是介于分批发酵和连续发酵之间的一种发酵技术，是指在微生物分批发酵中，以某种方式向培养系统补加一定物料的培养技术；

优点：补料分批发酵既可以保证微生物生长的需要，又不造成不利的影响，从而达到提高产率的目的；

补料分批发酵可以分为两种类型：单一补料分批发酵和反复补料分批发酵。

2、发酵工艺控制:温度、pH值、溶解氧的浓度、种龄与接种量

五、发酵设备

1、定义：进行微生物深层培养的设备。

2、应具备的条件：

 严密的结构

 良好的液体混合能力

 较高的传质、传热速率

 同时还应具有配套而又可靠的检测及控制仪表。

3、分类：

 微生物种类划分：好氧发酵设备和厌氧发酵设备；

 根据搅拌方式划分：好氧发酵设备又可以分为机械搅拌式发酵罐和通风搅拌式发酵罐。

第五章  酶工程

一、酶工程的定义

酶工程是是研究酶的生产和应用的一门技术性学科，包括酶制剂的制备、酶的固定化、酶的修饰与改造及酶反应器等方面的内容，是酶学和工程学相互渗透结合形成的一门新的技术科学，是酶学、微生物学的基本原理与化学工程有机结合而产生的边缘科学。 

二、酶的分类、组成、结构特点和作用机制

1、酶的分类：氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂合酶、异构酶、连接酶（合成酶）、核酸酶。

2、酶的组成和结构特点

1）单体酶

2）寡聚酶

3）多酶复合体

多酶复合体组成部分：

 辅因子：酶蛋白中非蛋白质部分，它可以是无机离子也可以是有机化合物。

 辅酶：有机辅因子与酶蛋白结合松散即为辅酶。

 辅基：有机辅因子与酶蛋白结合紧密即为辅基。 

3、酶的作用机制 

1）酶的作用过程

 酶的活性部位：是它结合底物和将底物转化为产物的区域，通常是整个酶分子相当小的部分，它是由在线性多肽中可能相隔很远的氨基酸残基形成的三维实体。

2）酶与底物的结合模型

 锁和钥匙模型

 诱导锲合模型

3）酶的催化作用

 广义的酸碱催化

 共价催化

 邻近效应及定向效应：所谓邻近效应就是底物的反应基团与酶的催化基团越靠近，其反应速度越快。

 变形或张力

 酶的活性中心为疏水区域

三、酶作为催化剂的显著特点

1、催化能力

催化转换数：每个酶分子每分钟催化底物转化的分子数；

一般为103min-1，碳酸酐酶最高为3.6* 107min-1

有酶加入比无酶参加反应速度一般要高107-1013

2、专一性

绝对专一： 只催化一种底物进行快速反应，甚至是立体专一性；

相对专一性：基团专一和键专一 

3、调节性

酶浓度的调节 

激素调节 

共价修饰调节 

性蛋白水解作用与酶活力 

抑制剂的调节 

反馈调节 

金属离子和其他小分子化合物的调节

四、酶抑制作用的概念和分类

1、概念：能降低酶催化反应速度的因素。

2、分类

失活作用：是指由于一些物理因素和化学试剂部分或全部破坏了酶的三维结构，即引起酶蛋白变性，导致部分或全部丧失活性。

抑制作用：是指在酶不变性的情况下，由于必需基团或活性中心化学性质的改变而引起的酶活性的降低或丧失。 

去激活作用：某些酶只有在金属离子存在下才有活性，去除金属离子也会引起这些酶活性的降低或丧失。

阻遏作用：指某些因素（如激素或药物等）使细胞内酶蛋白的合成减少，反应速度的降低是由于酶分子数量的减少，每分子酶的催化效力并无变化.

3、抑制程度的表示

一般用反应速度的变化来表示。若以不加抑制剂时的反应速度为 Vo，加入抑制剂后的反应速度为Vi，则酶的抑制程度有下列几种表示方法：

 相对活力分数（残余活力分数）

a=Vi/Vo

 相对活力百分数（残余活力百分数）

a%==Vi/Vo*100%

 抑制分数：指被抑制而失去活力的分数i=1-a=1-Vi/Vo

 抑制百分数

i%=(1-a)*100%==(1-Vi/Vo)*100%

通常所谓抑制率是指抑制分数或抑制百分数。 

4、抑制作用的分类 

 不可逆抑制作用：非专一性不可逆抑制作用和专一性不可逆抑制作用；

 可逆抑制作用（竞争性抑制作用，非竞争性抑制作用，反竞争性抑制作用，混合型抑制）

五、酶的发酵生产

1、优良产酶菌种的筛选

1）发展微生物作为酶生产来源的原因

 微生物生长繁殖快，生活周期短，产量高，单位干重产物的酶比活很高；

 微生物培养方法简单，所用的原材料大都为农副产品，来源丰富，价格   低廉，机械化程度高，经济效益高；

 微生物菌株种类繁多，酶的品种齐全；

 微生物有较强的适应性和应变能力，可以通过适应、诱导、诱变及基因工程等方法培育出新的产酶量高的菌种。

2）优良的产酶菌种应该具备的条件

1）繁殖快，产酶量高，有利于缩短生产周期；

2）能在便宜的底物上生长；

3）产酶性能稳定，菌株不易退化，不易受噬菌体侵袭；

4）产生的酶容易分离纯化；

5）不是致病菌及产生有毒物质或其他生理活性物质的微生物，才能确保酶生产和应用的安全。

3）产酶菌种的筛选方法

1）含菌样品的采集

2）菌种的分离与纯化

3）产酶性能的测定及复筛

4）对于胞外酶的产酶菌株，经常采用分离定性和半定量测定产酶性能相结合的方法，使之在培养皿分离时就能大致了解菌株的产酶性能；

2、微生物酶的发酵生产

1）定义：微生物酶的发酵生产是指在人工控制的条件下，有目的地利用微生物培养来生产所需的酶，其技术包括培养基和发酵方式的选择及发酵条件的控制管理等方面的内容。

2）培养基

1微生物酶发酵生产中对培养基的要求

 大多数工业用酶的合成受底物的诱导和分解代谢物的阻遏的双重调节作用，为提高酶的产量，应向培养基中添加适量的诱导物，并尽量减少阻遏物的浓度；

 其次，各种营养物质的比例要适当，同时，还应创造一个适于微生物生长和产酶的酸碱度环境；

 应注意到有些微生物生长繁殖的培养基不一定有利于酶的合成；

3）培养基的组成:碳源、氮源、无机盐类、生长因子。

4）酶的发酵生产方法：

包括固体发酵和液体深层发酵两种

固体发酵方法：主要是用于真菌来源的商业酶生产，其中用米曲霉生产淀粉，以及用曲霉和毛酶生产蛋白酶在中国和日本已经有悠久的历史。这种方法操作简单，但发酵条件不易控制；

液体深层发酵方法：现在大多数的酶是通过液体深层发酵培养生产的。液体深层发酵应注意：温度、通气和搅拌。pH值的控制等。

5）提高酶产量的措施

添加诱导物：一般分为三类：酶的作用底物（如青霉素是青霉素酰化酶的诱导物）、酶的反应产物（如纤维素二糖可诱导纤维素酶的产生）、酶底物的类似物（如异丙基--D-硫代半乳糖苷（IPTG）对-半乳糖苷酶具有诱导作用）;

降低阻遏物质的浓度：微生物酶的生产受到代谢末端产物的阻遏和分解代谢物阻遏的调节。为避免分解代谢物的阻遏作用，可采用难于利用的碳源，或采用分次添加碳源的方法使培养基中的碳源保持在不至于引起分解代谢物阻遏的浓度。

添加表面活化剂：在酶的发酵生产中，非离子型的表面活化剂常被用作产酶促进剂，其机理可能是其改变了细胞的通透性，使更多的酶从细胞内透过细胞膜泄漏出来，从而打破了胞内酶合成的反馈平衡，提高了酶的产量；另外有些表面活性剂对酶分子有一定的稳定作用，可以提高酶的活力；

添加产酶促进剂：是指能提高酶产量的物质，其作用机理可能是酶的激活剂或稳定剂，也可能是产酶微生物的生长因子或有害金属的熬合剂，利用添加植酸钙可使多种霉菌的蛋白酶和橘青霉的5‘-磷酸二酯酶提高2～20倍。

六、酶的分离与纯化

1、酶的分离与纯化的注意事项

温度：整个提纯操作应在低温下（0-4℃ ）进行，以防止蛋白水解酶对目的酶的降解；

pH值：在提纯过程中一般采用缓冲液作为溶剂，防止过酸或过碱；

盐浓度：因为大多数蛋白质具有盐溶性质，所以在提纯过程中应选用合适浓度的盐溶液以促进蛋白质的溶解，盐浓度过高，酶容易变性；

搅拌：剧烈搅拌容易引起蛋白质的变性，提纯中应避免剧烈搅拌和产生泡沫；

酶液是微生物生长的良好培养基，在提纯过程中应尽可能防止微生物对酶的破坏。

2、酶制剂的制备

破碎细胞：主要针对胞内产酶。动植物细胞常用高速组织捣碎机和组织匀浆器破碎，而微生物组织的破碎则有机械破碎法、酶法、化学试剂法和物理破碎法等；

溶剂抽提：大多数酶蛋白都可用稀酸、稀碱或稀盐溶液浸泡抽提，具体选用何种溶剂和抽提条件视酶的溶解性和稳定性而定；

离心分离：是酶分离提纯中最常用的方法，主要用于除去发酵液中的菌体残渣或抽提过程中生成的沉淀物。工业上常用板框压滤机来完成酶的粗分离；

浓缩：由于发酵液酶抽提液中酶的浓度一般都比较低，必须经过进一步纯化以便保存、运输和应用。可采用吸附、沉淀、凝胶过滤等方法进行酶的浓缩，工业上常采用真空薄膜浓缩法以保证酶在浓缩过程中不失活；

干燥：酶溶液或含水量高的酶制剂即使在低温下也极其不稳定，只能作短期保存。常用的干燥方法有真空干燥、冷冻干燥和喷雾干燥等。

3、酶的纯化与精制

医药、分析、测试等用酶必须使用精制品，因此必要进一步进行酶的纯化与精制；

酶的纯化与精制方法：

根据分子大小和形状的分离方法：包括离心分离、差速离心和等密度梯度离心分离、凝胶过滤、透析与超滤等；

根据酶分子电荷性质的分离方法：离子交换层析、层析聚焦、电泳和等电聚焦电泳等；

根据酶分子专一性结合的分离方法：亲和层析、免疫吸附、亲和层析和共价层析；

根据分配系数的分离方法：双水相萃取分离（由于生物活性物质在两项中具有不同的分配比，经过反复处理则可达到分离的目的）；常用于生物物质分离的体系有聚已二醇（PEG）/葡聚糖、PEG/磷酸盐、PEG/硫酸氨等。

4、酶的纯度与酶活力

酶的纯度可用酶的比活力来衡量；

比活力：是以每毫克蛋白所具有的酶活力单位数；一般情况下，酶的比活力随酶的纯度的提高而提高；

5、酶制剂的保存

酶的保存条件应注意：

1)温度：酶的保存温度一般在0-4 ℃。

2)缓冲液：为酶的保存提供较为稳定的环境，尤其是pH值。

3)氧防护：由于巯基等酶分子基团或Fe-S中心等容易为分子氧所氧化，固这类酶应加巯基保护剂或在氩或氮气中保存；

4)蛋白质的浓度及纯度：一般说，酶的浓度越高，酶越稳定，制备成晶体或干粉更有利于保存。此外还可以加入酶的各种稳定剂如底物、辅酶、无机离子等来较强酶稳定性，延长酶的保存时间。

七、酶分子的改造和修饰

1、酶分子改造的原因

1）酶一旦离开生物细胞，离开特定的环境条件，常常不太稳定，不适应大量生产的需要；

2）酶作用的最适pH值条件一般在中性，但在工业应用中，pH值往往偏离这个范围，使酶难以发挥作用；

3）在临床上，绝大多数的酶对人体而言都是外源蛋白质，具有抗原性，直接注入引起人体的过敏反应；

2、酶分子改造的途径

1）通过酶分子修饰方法改变天然酶的结构；

2）通过生物工程的方法改造编码酶分子的基因达到改造酶的目的。

3、酶分子改造的目标：

1）提高酶活力

2）改进酶的稳定性

3）允许酶在一个变化的环境中发挥作用

4）改变酶最适的pH值或温度

5）改变酶的特异性使它能催化不同底物的转化

6）改变酶催化反应类型

7）提高酶催化过程的反应效率

4、酶分子修饰

1）概念：酶分子修饰是指通过主链的剪接切割和侧链的化学修饰对酶分子进行改造，从而达到改变酶的一些性质，创造出天然酶不具备的某些优良性状，扩大酶的应用以达到较高的经济效益。

2）酶分子修饰常见的方法：部分水解酶蛋白的非活性主链、利用小分子或大分子物质对活性部位或活性部位以外的侧链基团进行共价修饰、酶辅因子的置换等。

3）优点：酶分子的化学修饰技术要求简单、容易见效。

4）酶的化学修饰:

概念：是利用修饰剂所具有的各类化学基团的特性，直接或经一定的活化步骤后与酶分子上的某些氨基酸残疾产生化学反应，从而改造酶分子的结构和功能；

化学修饰反应类型：酶分子侧链基团的化学修饰（酰化及其相关反应、烷基化反应、氧化和还原反应、芳香环取代反应等）、特定氨基酸残基侧链基团的化学修饰 （巯基的化学修饰 、氨基的化学修饰 、羧基的化学修饰 、咪唑基的化学修饰 、胍基的化学修饰等）。

酶分子的化学修饰应注意的问题：

修饰剂：一般情况下，要求修饰剂具有较大的分子量、良好的生物相容性和水溶性，修饰剂表面有较多的反应基团及修饰后酶的半衰期较长；

酶性质的了解

反应条件的选择：应尽可能在酶稳定的条件下进行反应，避免破坏酶活性中心功能基团。

5、生物酶工程

生物酶工程的内容：

 用基因工程技术大量生产酶；

 修饰酶基因，产生遗传修饰；

 设计出新酶基因，合成自然界从末有过的酶。

八、生物催化剂的固定化

1、概念：利用固定化的技术对酶加以改造固定，从而使其既具有酶的催化性质，又具有一般化学催化剂能回收、反复使用的优点，并在生产工艺上可以实现连续化和自动化的技术。

2、酶的固定化方法

1）载体结合法：包括物理吸附法、离子吸附法、 螯合法、共价结合法等。

2）共价交联法

3）包埋法

3、细胞的固定化方法

1）概念：细胞固定化是将完整细胞固定在载体上的技术。

2）优点：它免去了破碎细胞提取酶等步骤，直接利用细胞内的酶，因而固定后酶活基本没有损失。另外由于保留了胞内原有的多酶系统，对于多步催化转换的反应，优势更加明显，而且无需辅酶的再生。

3）细胞固定化的方法：包埋法、吸附法。 

4）固定化酶（细胞）的性质

酶活力的变化：固定化酶的活力在多数情况下比天然酶的活力低，专一性也可能发生改变。其原因可能是：①酶构象的改变导致了酶与底物结合能力或催化底物转化能力的改变；②载体的存在给酶的活性部位或调节部位造成了某种空间障碍，影响酶与底物或其他效应物的作用；③底物与酶的作用受其扩散速率的。

酶稳定性提高: 大多数酶经过固定化后，其稳定性都有所提高，这对于实际应用是十分有利的。酶的稳定性包括热稳定性、对各种有机试剂的稳定性、对pH的稳定性、对蛋白水解酶的抗性及存储稳定性等。固定化酶的稳定性提高的原因可能是由于固定化后酶与载体多点连接或酶分子间的交联，防止了酶分子的伸展变形，同时也抑制了自降解反应。

最适pH值的变化: 酶固定化后，催化底物的最适pH值和pH值活性曲线经常发生变化，其原因是微环境表面电荷的影响。

最适温度的提高: 酶反应得最适温度是酶失活速度与酶反应速度综合的结果，在一般情况下，固定化后的酶失活速度下降，所以最适温度也随之提高。

动力学常数的变化

5）固定化酶（细胞）的评价指标

相对酶活力：具有相同酶蛋白量的固定化酶与游离酶活力的比值。相对酶活力低于75％的固定化酶，一般没有实际应用价值

酶的活力回收率：固定化酶的总活力与用于固定化的酶总活力之百分比。测定酶的活力回收率可以确定固定化的效果。

固定化酶的半衰期：即固定化酶的活力下降到为初始活力一半所经历的时间，用t1/2表示，它是衡量固定化酶操作稳定性的关键。

九、酶的应用

1、酶反应器：以酶为催化剂进行反应所需要的设备称之为酶反应器。酶反应器有两种类型：一类是直接应用游离酶进行反应，即均相反应器；另一类是应用固定化酶进行的非均相酶反应器。

2、酶反应器的基本类型：

搅拌罐型反应器

固定床型反应器

流化床型反应器

膜式反应器

3、酶反应器的操作

酶反应器的微生物污染

酶反应器中流动方式的控制

酶反应器恒定生产能力的控制

4、酶反应器的性能评价指标：

空时：指底物在反应器中的停留时间，数值上等于反应器体积与底物体积流速之比，所以又称为稀释率。

     转化率：是指每克底物中有多少被转化为产物；

     生产强度：每小时每升反应器体积所生产的产品克数来表示，主要取决于酶的特性、浓度及反应器特性、操作方法等。

5、生物传感器

1）定义：是用生物活性物质做敏感器件，配以适当的换能器所构成的分析工具（分析系统）。

2）生物传感器工作原理：待测物质经扩散作用进入固定化生物敏感膜层，经分子识别，发生生物化学反应，产生的信息继而被相应的化学或物理换能器转化为可定量和可处理的电信号，再经仪表的放大和输出，便可知道待测物的浓度。

生物敏感膜：又称分子识别元件，是生物传感器的关键元件，它是由对待测物质（底物）具有高选择性分子识别能力的膜构成的，直接决定了传感器的功能和质量。其可以是酶膜、细胞膜、免疫膜和细胞器膜等。

固定方法：在生物传感器内，生物活性材料是固定在换能器上的，常用的固定方法有六种：夹心法，包埋法，吸附法，共价结合法，交联法和微胶囊法。

输出信息的多元化：生物化学反应过程中产生的信息是多元化的，它可以是化学物质的消耗或产生，也可以是光和热的产生，因而对应得换能器的种类也是多样的。目前生物传感器中研究最多的是电化学生物传感器，这类传感器中，换能器主要有电流型和电位型两类。

3）生物传感器的分类

酶传感器

组织传感器

微生物传感器

免疫传感器

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